Ultra-fast liquid chromatography using the Agilent 1100 Series HPLC system and 1.8-μm ZORBAX SB C18 Rapid Resolution HT columns

Význam tématu

Liquid chromatography je základním nástrojem pro analýzu čistoty, stability a metabolických vlastností sloučenin ve farmaceutickém, chemickém i průmyslovém prostředí. S rapidním nárůstem počtu vzorků v high-throughput laboratořích roste i potřeba zkrátit dobu analýzy bez kompromisů v rozlišení či robustnosti měření.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje optimalizaci konfigurace Agilent 1100 Series HPLC systému ve spojení s 1,8µm ZORBAX SB C18 Rapid Resolution HT columns pro dosažení ultra-rychlých LC analýz. Autoři demonstrují separaci 9 alkylfenonů za méně než 30 sekund a ověřují dlouhodobou stabilitu systému přes 8 000 injekcí.

Použitá instrumentace

• Agilent 1100 Series binary pump s minimálním dutým objemem a variabilní technologií krokových zdvihů
• Agilent 1100 Series well-plate autosampler s možností automatického snížení retardančního objemu (ADVR) a překrytých injekcí (OI)
• Agilent 1100 Series thermo­statovaná kolonní komora s integrovaným 2-polohovým/10-portovým ventilem
• Dodatečný pump pro alternativní regeneraci kolony (isokratický či gradientní)
• Agilent 1100 Series diode-array detektor s 500 nL průtokovou kyvetou
• ZORBAX SB C18 Rapid Resolution HT kolony 4,6×50 mm, 1,8 µm

Použitá metodika

Analýzy probíhaly v režimu gradientu A (voda + 0,1 % HCOOH) až B (acetonitril + 0,1 % HCOOH) při 32 °C. Vzorky 1 µL se aplikovaly s ADVR pro snížení mrtvého objemu na 6 µL a překrytými injekcemi (OI) pro zkrácení cyklu. Pro potlačení carry-over byl využit režim MCO s násobným proplachem jehlového systému. Alternativní regenerace kolony pomocí 2-polohového ventilu umožnila provádět regeneraci jedné kolony při práci druhé.

Hlavní výsledky a diskuse

Baseline separace 9 alkylfenonů do 29 s při backpresu 300–383 bar s průměrným W4s 0,5 s a Rs(4,5) ≥ 2,65. Zvýšení průtoku z 2,3 na 4,35 mL/min vedlo ke zkrácení retenčního rozdílu z 0,68 na 0,49 min, přičemž vyšší teplota do 60 °C snížila tlak o 32 %. Alternativní regenerace zkrátila cyklus na 0,8 min. Carry-over byl eliminován režimem MCO s flush-out faktorem ≥ 20. Dlouhodobý test 8 000 injekcí prokázal stabilní W1/2 i DRT a trvanlivost kolon.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy high-throughput projektů
• Zvýšení kapacity zařízení díky překrytým injekcím a automatické regeneraci kolon
• Minimální mrtvý objem a potlačené carry-over vhodné pro stopové analýzy
• Robustní provoz a dlouhá životnost kolon v nepřetržitém režimu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směry zahrnují přesun k ještě vyššímu tlaku (UPLC/UPLC-MS), vývoj nových sub-2 µm peptidových a superficially porous částic, rozšíření teplotního rozsahu a plnou integraci s automatizovanými systémovými pracovními postupy a datovými platformami pro rychlou syntézu a screening.

Závěr

Kombinace optimalizovaného Agilent 1100 Series systému a ZORBAX SB C18 RRHT kolon umožňuje dosáhnout ultra-rychlých a vysoce rozlišovacích LC metod při tlacích do 400 bar. Metoda nabízí vynikající opakovatelnost, nízký carry-over a dlouhodobou stabilitu, což ji činí ideální pro moderní high-throughput a QC aplikace.

Reference

• 1. Increasing Sample Throughput Using ZORBAX Eclipse XDB C18 Rapid Resolution HT Columns, Software Factory Application Note 5988-9997EN, 2003
• 2. High efficiency, high throughput LC and LC/MS applications using ZORBAX Rapid Resolution HT columns, Agilent Technologies Application Note 5989-0540EN, 2004
• 3. ZORBAX Rapid Resolution HT Columns A Breakthrough in High-Throughput HPLC Column Technology, Agilent Technologies Application Note 5989-0599EN, 2004
• 4. High throughput HPLC Alternating column regeneration with the Agilent 1100 Series valve solutions, Agilent Technologies Application Note 5988-7831EN, 2002
• 5. Ultra Performance LC by Design Brochure, Waters Brochure 720000880EN, 2004