End-to-End Workflow Solutions for Oligonucleotide Analysis

Význam tématu

Analytická charakterizace syntetických oligonukleotidů je klíčová pro jejich využití v biofarmaceutickém výzkumu, genetickém testování a výrobě léčiv. Kontrola čistoty, sekvence, hmotnosti a úrovně nečistot zajišťuje bezpečnost a účinnost cílených terapeutik, včetně siRNA, antisense oligonukleotidů, aptamerů a CRISPR průvodců.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje komplexní pracovní postupy (workflows) pro analýzu oligonukleotidů od přípravy vzorku až po datovou analýzu, kombinuje metody LC/UV, LC/MS, LC/Q-TOF a LC/MS/MS a uvádí optimální konfigurace instrumentace a softwaru pro čtyři hlavní aplikace:

• Analýza čistoty a separace nečistot (Workflow 1)
• Profilování produktově souvisejících nečistot (TPI) pomocí LC/MS (Workflow 2)
• Potvrzení sekvence s využitím MS/MS fragmentace (Workflow 3)
• Purifikace analytické a preparativní škály (Workflow 4)

Použitá metodika a instrumentace

Postupy zahrnují několik kroků:

• Příprava vzorku: filtrace a SPE kazety, 96-well DNA destičky
• Separace: silná aniontová výměna (SAX), ion-pair reversed-phase (IP-RP), hydrofobní interakce nebo HILIC
• Detekce: UV (VWD/DAD) a hmotnostní spektrometrie (LC/MSD XT, LC/TOF, LC/Q-TOF)
• Analýza dat: OpenLab ChemStation/CDS a Agilent MassHunter BioConfirm

Hlavní instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II BioLC a 1260/1220 Infinity II Analytical-Scale LC
• Agilent 6230B TOF LC/MS, 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• AdvanceBio a PLRP-S kolony ve formátech analytické, semipreparativní a preparativní
• Software: OpenLab ChemStation/CDS, MassHunter BioConfirm v12.0

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow 1 prokázalo efektivní oddělení plnohodnotného produktu od konstrukčních nečistot (trunkace, chybějící modifikace) pomocí SAX nebo IP-RP a detekci UV/MS. Workflow 2 pomocí LC/MS a BioConfirm automatizuje profilování nečistot s nízkou abundancí a usnadňuje porovnání naměřených a teoretických hmotností či izotopických vzorců. Workflow 3 ukázalo, že cílená MS/MS fragmentace na Q-TOF dokáže potvrdit sekvenci a lokalizovat modifikace, což posiluje důvěru v integritu molekuly. Workflow 4 demonstrovalo škálovatelnost metod pro analytické i preparativní purifikace s vysokým výtěžkem a čistotou.

Přínosy a praktické využití metody

Tyto integrované postupy umožňují:

• Rychlou validaci syntézy oligonukleotidů v R&D a výrobě
• Spolehlivé QA/QC testy pro klinické a komerční produkty
• Automatizované zpracování dat s minimalizací chyb lidského faktoru
• Široké uplatnění v genové terapii, diagnostice a vývoji vakcín

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj vysokorychlostních a vysokorozlišovacích MS technik, rozšíření softwarových nástrojů pro strojové učení a podporu multi-omics integrace. Automobilizace pracovních postupů a miniaturizace přístrojů pak přispějí k vyšší propustnosti a nižším nákladům na analýzu.

Závěr

Popsané end-to-end workflow poskytuje robustní a flexibilní řešení pro komplexní analýzu oligonukleotidů, od kontroly čistoty až po potvrdění sekvence a purifikaci v různých měřítcích. Integrace moderní LC a MS techniky s pokročilým softwarovým zpracováním zvyšuje spolehlivost výsledků a urychluje vývoj bioterapeutik.

Reference

1. Hsiao J, Apffel A, Turner M. Optimizing Separation of Oligonucleotides with Anion-Exchange Chromatography. Agilent Technologies application note 5994-4753EN, 2022.
2. Schneider S. Comparability Studies for the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems. Agilent Technologies application note 5994-4392EN, 2021.
3. Rye P. High-throughput, Ion-Pairing-Free HILIC Analysis of Oligonucleotides Using Agilent RapidFire Coupled to Q-TOF MS. Agilent Technologies application note 5994-4945EN, 2022.
4. Wong DL, Rye P. An Integrated Workflow for the Analysis of Oligonucleotides and Their Impurities by High-Resolution LC/(Q-)TOF MS. Agilent Technologies application note 5994-4817EN, 2022.
5. Li G, Rye P. MS/MS Oligonucleotide Sequencing Using LC/Q-TOF with HILIC Chromatography. Agilent Technologies application note 5994-5632EN, 2023.
6. Liau B. Analysis of mRNA Poly-A Sequence Variants by High-Resolution LC/MS. Agilent Technologies application note 5994-3005EN, 2021.
7. Rieck F. Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC/MS and Software Support. Agilent Technologies application note 5994-4877EN, 2022.
8. Pulliere F, Welsby C. Identification of Commercially Available Oligonucleotide Starting Materials by Vaya Raman. Agilent Technologies application note 5994-4239EN, 2021.
9. Vanhoenacker G, Lecluyse C, Debyser G, Sandra P, Sandra K, Schipperges S, Schneider S, Huber U. Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Technologies application note 5994-2957EN, 2021.
10. Duong P, Bidlingmeyer BA, Zhu A, Luke S. Fast and High-Resolution Reversed-Phase Separation of Synthetic Oligonucleotides. Agilent Technologies application note 5991-6006EN, 2017.
11. Wong DL. Mass Spectrometric Characterization of Antibody-siRNA Conjugates Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies application note 5994-2155EN, 2020.