Screening Method for Fluoroquinolones Using an Advanced UHPLC Column and System Combination

Význam tématu

Fluorochinolony představují širokospektrátní antibiotika významná v živočišné výrobě i klinické praxi. Jejich polyaromatická struktura s fluorovými atomy a karboxylovou skupinou však vede k interakcím se silanoly na běžných C18 fázích, což zhoršuje tvar píku a rozlišení. Vysoce účinná UHPLC metoda pro rychlý screening těchto látek je klíčová pro kontrolu kvality, regulační dohled a monitoring reziduí v potravinách či životním prostředí.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní UHPLC metodu pro paralelní detekci 25 fluorochinolonů s využitím C18 kolony Hypersil GOLD VANQUISH (1,9 µm, 200 × 2,1 mm) a systému Vanquish UHPLC. Studie demonstrovala použití nelineárního gradientu pro zlepšení separace složitých směsí bez použití hmotnostní detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Spotřební materiál:

• Hypersil GOLD VANQUISH 1,9 µm UHPLC kolona, 200 × 2,1 mm
• UHPLC-MS grade voda a acetonitril, formiová kyselina 0,1 % (voda i acetonitril)
• Normální a wide opening 2 mL vialy s uzávěrem

Instrumentace:

• Vanquish UHPLC systém se split samplerem HT, binárním pumpou H, aktivním předhřevem a komorou kolony H
• Diode Array Detector HL s LightPipe flow cell 10 mm
• Chromeleon 7.2 SR2 pro řízení analýzy a zpracování dat

Podmínky separace:

• Mobilní fáze A: 0,1 % formiová kyselina ve vodě, B: 0,1 % formiová kyselina v acetonitrilu
• Tok 0,4 mL/min, teplota kolony 40 °C, injekční objem 1 µL
• Nelineární gradient (curve 8) z 10 % B na 60 % B během 17 min s celkovou délkou běhu 24 min

Výroba vzorků:

• 25 fluorochinolonů v primárních roztocích 1 mg/mL ve vodě/methanol (1:1) s přídavkem kyseliny
• Pracovní koncentrace 100 µg/mL připravené ředěním v tomtéž rozpouštědle

Hlavní výsledky a diskuse

Nelineární gradient umožnil adekvátní rozlišení všech hlavních analyzovaných látek během 24 min. Přesné retence 25 piramidických, fluorochinolonových a chinolonových derivátů jsou stabilní s RSD retence pod 0,1 %. Průměrná rozlišení USP u většiny párů je nad 1,0 a u klíčových párů dosahuje i hodnot nad 5, což je dostačující pro screening bez MS detekce. Nízkodisperzní konstrukce systému Vanquish spolu s inteligentním předstlačením vzorku zajišťují mimořádnou opakovatelnost retenčních časů (do 0,05 % RSD) a konzistentní kvalitu špiček.

Pokročilé algoritmy detekce a zpracování v Chromeleon usnadňují vývoj metod i při částečně překryvných pí­cích. Ve srovnání se systémy vyžadujícími MS detekci poskytuje navržená metoda dostatečné rozlišení pouze s UV detektorem, což zkracuje čas analýzy a snižuje náklady.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý screening širokého spektra fluorochinolonů pro QA/QC laboratoře
• Minimální potřeba úprav vzorku a pufrů díky stabilní C18 fází Hypersil GOLD VANQUISH
• Šetření času i rozpočtu díky UV detekci bez nutnosti MS
• Vysoká reprodukovatelnost a opakovatelnost vhodná pro rutinní sledování reziduí

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k integraci rychlých skenů s tandemovou hmotnostní spektrometrií pro potvrzování identit, vývoji ještě účinnějších stacionárních fází pro vylepšení rozlišení kritických párů a nasazení umělé inteligence pro automatizované vyhodnocení složitých chromatogramů. Růst poptávky po monitoringu environmentálních reziduí a zhoršených pacientských vzorcích povede k dalšímu zpřesnění detekčních limitů a zrychlení analýz.

Závěr

Použití kolony Hypersil GOLD VANQUISH 1,9 µm v systému Vanquish UHPLC pro screening fluorochinolonů prokázalo vysokou účinnost separace i při komplexních směsích. Výsledná metoda nabízí vynikající opakovatelnost, dostatečné rozlišení a zjednodušenou analýzu pouze s UV detekcí. Díky tomu je vhodná pro rutinní kontrolu kvality a regulaci reziduí.

Reference