Metabolomic differential analysis of gene-mutated Drosophila using GC/MS

Význam tématu

Metabolomická analýza genetických modifikací v Drosophila melanogaster odhaluje dopady mutací na buněčné dráhy, což je klíčové pro výzkum onemocnění, identifikaci biomarkerů a vývoj personalizované medicíny.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo porovnat metabolitové profily divokého typu a geneticky mutovaných žlutých Drosophila prostřednictvím GC-MS a pokročilých statistických metod. Bylo připraveno celkem pět vzorků z 50 mušek, přičemž dva vzorky představovaly divoký typ a tři genetické varianty.

Použitá metodika a instrumentace

Postup vzorků:

• Homogenizace 10 mušek na vzorek a extrakce metabolitů směsí methanol voda chloroform (2.5:1:1).
• Lyofilizace vodné fáze po odpaření methanolu.
• Derivatizace metoxaminací v pyridinu a trimethylsilylací pomocí MSTFA.

Instrumentace:

• GC-MS: GCMS-TQ8040 NX
• Autosystémy: AOC-20i Plus (injektor), AOC-20s Plus (sampler)
• Kolona: 30 m × 0.25 mm I.D., df=1.0 µm
• Režim sběru dat: Multiple Reaction Monitoring (MRM), až 604 látek za 37 minut
• Software: LabSolutions Insight pro předzpracování, Multi-omics Analysis Package pro statistické vyhodnocení

Hlavní výsledky a diskuse

Celkem bylo detekováno přibližně 300 metabolitů na vzorek. Analýza varianční PCA ukázala jasné rozdělení mezi divokým typem a genetickými variantami, přičemž první hlavní komponenta (PC1) pokryla 55,4 % variability.
Hierarchické shlukování potvrdilo odlišné metabolomické vzorce, s mírnou variabilitou u třetí genetické varianty.
Volcano plot identifikoval významné změny:

• Zvýšené koncentrace v mutantech: cystein, katechol, uridin, 2-hydroxyglutarát, N-acetyltyrosin
• Snížené koncentrace v mutantech: sacharopin, cystathionin, tryptofan, 2-aminobutyrát, kynurenin, 5-hydroxytryptofan, histamin

Metabolické mapy odhalily pokles klíčových tryptofanových drah, například konverze na kynurenin a 5-hydroxytryptofan, což bylo potvrzeno chromatogramy.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní profilace metabolitů pro studium genotypových rozdílů
• Rychlá a citlivá detekce pomocí MRM zkracující dobu analýzy
• Intuitivní grafická rozhraní pro neomalé uživatele (PCA, shlukování, vulkanoploty, metabolické mapy)
• Možnost integrace s platformou GARUDA a dalšími omics daty

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na jiné modelové organismy a lidské vzorky
• Propojení genomiky a metabolomiky pro personalizovanou medicínu
• Automatizované pracovní postupy s vyšším průtokem vzorků a umělou inteligencí
• Optimalizace databází pro rychlejší a přesnější identifikaci metabolitů

Závěr

Použitá GC-MS metoda s GCMS-TQ8040 NX ve spojení s Multi-omics Analysis Package umožnila účinně odhalit a vizualizovat metabolomické rozdíly mezi divokým typem a geneticky mutovanými Drosophila. Statistické nástroje jako PCA, hierarchické shlukování a vulkanoploty usnadnily identifikaci klíčových biomarkerů spojených s genotypovými změnami.

Reference

1. Japan Agency for Medical Research and Development Press Release A part of the effect of different genomes on metabolites 18. 8. 2016 Online accessed 20 June 2022
2. Shimadzu Corporation Metabolomics Pretreatment Handbook Online accessed 9 June 2022