FTIR Microscopic Imaging of Large Samples with 4x and 15x Infrared Objectives: A Case Study of a Carcinoma Tissue Section

Význam tématu

Fourierova transform-infračervená (FTIR) mikroskopická zobrazovací technika umožňuje nerušenou chemickou charakterizaci biologických vzorků s prostorovým rozlišením. Zvýšení velikosti pole zobrazení (FOV) pomocí nižších zvětšení představuje zásadní krok k urychlení měření rozsáhlých tkáňových řezů, a to při zachování dostačující kvality spekter pro diagnostické i výzkumné účely.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem případové studie bylo porovnat výkon FTIR zobrazování karcinomového řezu hrtanu o rozměrech cca 8×6 mm pomocí dvou IR objektivů (4× a standardní 15×). Studie sledovala:

• Rozdíly ve velikosti snímaného pole (FOV) a související dobu sběru dat.
• Kvalitu spekter v klíčových spektrálních pásmech.
• Schopnost rozlišit pět tkáňových tříd metodou lineární diskriminační analýzy (LDA).

Použitá metodika a instrumentace

• FTIR zobrazovací mikroskop Agilent Cary 620 spojený s FTIR spektrometrem Agilent Cary 670.
• Fokalní rovinná pole (FPA) detektor 64×64 pixely; pro rozšíření FOV možnost rozšíření na 128×128 pixely.
• IR objektivy: vlastnoručně vyvinutý 4× (FOV až 2,4×2,4 mm na 128×128) a standardní 15× (FOV 350×350 µm na 64×64).
• Měřicí parametry: spektrální rozlišení 4 cm⁻¹, 16 akumulací vzorku, 32 akumulací pozadí, UDR 4 (spektrální rozsah do 3975 cm⁻¹), nízkoprůchodový optický filtr.
• Předzpracování: odebrání spekter nízké kvality, baseline korekce, normalizace.
• Datová analýza: export do prostředí R s balíčkem hyperSpec, klasifikace pomocí LDA (toolbox cbmodel).

Hlavní výsledky a diskuse

• FOV při 4× se zvyšuje 3,4×3,4×3,4≈11 × oproti 15×, což zkracuje dobu sběru z 10,5 h na 1 h a snižuje diskový prostor z 42,4 GB na 4,3 GB pro identickou plochu.
• SNR a uniformita osvětlení byly u obou konfigurací srovnatelné.
• Spektra z obou objektivů vykazují shodné charakteristické pásy (1200–1800 cm⁻¹), 15× lépe přenáší pásma pod 1100 cm⁻¹ díky reflexní Cassegrain geometrii.
• LDA umožnila rozlišit pět tříd: normální epitel, spojivové tkáně, zánět, dysplazii a karcinom s krevními elementy. Při 4× byly dobře zachyceny hlavní třídy, 15× poskytlo prostorové detaily (např. cévní lumina).

Přínosy a praktické využití metody

• 4× objektiv vhodný pro rychlé průřezové mapování velkých tkáňových vzorků – ideální pro předběžný screening.
• 15× objektiv nezbytný tam, kde je rozhodující analýza nízkofrekvenčních pásů (<1100 cm⁻¹) a detaily do velikosti kolem 5 µm.
• Možnost skladby mozaiky prakticky neomezuje plochu vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení větších FPA detektorů (128×128, 256×256) pro další urychlení sběru dat.
• Implementace pokročilých „on-the-fly“ algoritmů pro automatické skládání mozaiky a předzpracování.
• Využití umělé inteligence a hlubokých neuronových sítí pro rychlejší a přesnější klasifikaci tkáňových struktur.
• Rozšíření spektrálního rozsahu do středního a dalekého IR s cílem zachytit klíčové bio­chemické informace (minerály, lipidy, sacharidy).

Závěr

Studie prokázala, že volba mezi 4× a 15× IR objektivy představuje kompromis mezi rozsahem pole zobrazení a prostorovým rozlišením. 4× objektiv je efektivní pro rychlou detekci hlavních tkáňových komponent, zatímco 15× je nezbytný pro detailní analýzu jemných struktur a nízkofrekvenčních spektrálních pásem.

Reference

• Beleites C., Popp J., Krafft C., Kansiz M. FTIR Microscopic Imaging of Large Samples with 4× and 15× Infrared Objectives: A Case Study of a Carcinoma Tissue Section. Agilent Technologies Application Note, 2014.