Enzyme Histochemistry Using Mass Spectrometry Imaging

Význam tématu

Enzymová histochemie umožňuje lokalizovat a kvantifikovat aktivní enzymy v tkáňových řezech, což je klíčové pro porozumění biochemickým dějům v mozku, orgánech či modelech organismů. Tradiční metody vyžadují barvicí kroky, které omezují možnost simultánního zobrazení více aktivit a kvantitativní analýzu. Implementace zobrazování hmotnostní spektrometrií (MSI) nabízí přímou detekci produktů enzymatických reakcí s vysokým prostorovým rozlišením a potenciálem pro semikvantitativní vyhodnocení.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo nahradit sekundární reakci barevného vývoje přímým zobrazením produktů enzymatických reakcí pomocí MSI. Výzkum demonstroval lokalizaci aktivity acetylcholinesterázy (AChE) v řezech mozku myši a celých tělech Drosophila melanogaster za použití deuterovaného substrátu acetylcholin-d9.

Použitá metodika

Substrát acetylcholin-d9 byl manuálně nanesen na tkáňové řezy vzdušným štětcem. Enzymatická reakce probíhala 5 minut, po níž byla detekována přeměna na choline-d9. Standardizace využila korekci iontizační účinnosti obou molekul. Reakce byla ukončena aplikací matricové vrstvy α-cyano-4-hydroxycinnamové kyseliny (α-CHCA) dvoufázovou technikou parní depozice a následným ručním postřikem.

Použitá instrumentace

• Imaging mass microscope iMScope™ QT pro snímání MSI s prostorovým rozlišením 5–10 μm
• Matrix vapor deposition system iMLayer™ pro parní depozici matricové vrstvy
• Software IMAGEREVEAL™ MS pro vyhodnocení zobrazovacích dat
• Vzdušný štětec (airbrush) pro nanášení substrátu

Hlavní výsledky a diskuse

• Substrát acetylcholin-d9 byl zcela přeměněn na choline-d9 během 5 minut, což potvrzuje krátký reakční čas vhodný pro aplikaci v MSI.
• MSI obrazy odhalily vysokou aktivitu AChE v corpus striatum, hippocampu a hypothalamu myšího mozku, přičemž v corpus callosum a cerebellárním kortexu byla aktivita nízká.
• Pomocí inhibitorů iso-OMPA a galantaminu se podařilo rozlišit aktivity butyrylcholinesterázy (BuChE) a AChE, čímž se potvrdila specifičnost detekce.
• Metoda byla úspěšně rozšířena na celá těla Drosophila, kde se ukázala vysoká aktivita cholinesteráz v mozku a v thorakoabdominální oblasti.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímá detekce primárních produktů enzymatické reakce eliminuje potřebu sekundárních barevných reakcí.
• Metoda umožňuje semikvantitativní vyhodnocení enzymové aktivity v závislosti na úpravě substrátu a prostorovém rozlišení.
• Aplikovatelnost na různé modelové organismy a typy enzymů otevírá nové možnosti v neurochemii, patologii i farmakologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další třídy enzymů, například transferázy či různé hydrolázy.
• Integrace kvantitativních standardů a automatizovaných postupů nanášení substrátů.
• Vývoj metod pro simultánní zobrazení více enzymatických aktivit v jednom řezu.

Závěr

Metoda enzymové histochemie založená na MSI nabízí rychlou, specifickou a prostorově přesnou techniku pro vizualizaci a semikvantitativní analýzu enzymatické aktivity. Studie prokázala její využitelnost v mozkových řezech myši i na celých částech Drosophila, přičemž eliminovala limity konvenčních barevných reakcí a umožnila rozlišení aktivit AChE a BuChE.

Reference

1. Takamatsu H. Histochemische Untersuchungen der Phosphatase und deren Verteilung in verschiedenen Organen und Geweben. Trans Soc Pathol Jpn. 29:429 (1939).
2. Gomori G. Microtechnical demonstration of phosphatase in tissue sections. Proc Soc Exp Biol Med. 42:23 (1939).
3. Takeo E, Fukusaki E, Shimma S. A mass spectrometric enzyme histochemistry method developed for visualizing in situ cholinesterase activity in Mus musculus and Drosophila melanogaster. Anal Chem. 92:12379 (2020).
4. Shimma S et al. Alternative two-step matrix application method for imaging mass spectrometry to avoid tissue shrinkage and improve ionization efficiency. J Mass Spectrom. 48:1285 (2013).
5. Toutant JP. Insect acetylcholinesterase: catalytic properties, tissue distribution and molecular forms. Prog Neurobiol. 32:423 (1989).
6. Chadwick LE. Actions on Insects and Other Invertebrates. In Cholinesterases and Anticholinesterase Agents, Koelle GB, Ed. Springer Berlin Heidelberg; 741–798 (1963).
7. Zador E. Tissue specific expression of the acetylcholinesterase gene in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet. 218:487 (1989).