Sensitivity and acquisition speed with triple quadrupole technology

Význam tématu

Ultra-výkonná kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS/MS) se stala klíčovou technikou v kvantitativní a kvalitativní analýze širokého spektra sloučenin. Dosažení vysoké citlivosti a současně rychlého získávání dat je nezbytné pro analýzu úzkých chromatografických píků a multi-analytové metody v oblasti farmacie, potravinářství, životního prostředí či klinických laboratoří. Optimalizace parametrů jako je doba detekce (dwell time), přepínací časy a počet vybraných reakcí (SRM) přímo ovlivňuje kvalitu výsledků a provozní efektivitu laboratoře.

Cíle a přehled studie

Práce se zaměřuje na:

• definici citlivosti v kontextu LC-MS/MS a jejích kvantifikačních limitů (LoD, LoQ, IDL),
• diskusi metod pro výpočet poměru signál/šum a jejich variabilitu,
• vliv akvizičních parametrů (dwell time, interscan delay, SRMs/s) na výkon analýzy,
• srovnání rychlosti SRM módu a běžného skenování (Da/s).

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byla použita sestava UHPLC spojená s tripletním kvadrupólem TSQ™ Plus (Thermo Fisher Scientific). Klíčové prvky instrumentace:

• tranzitní režim SRM (vybrané reakce) s možností pozitivního i negativního iontování,
• doba detekce (dwell time) v rozmezí 0,5 ms až 10 ms,
• přepínací časy mezi SRM (< 5 ms),
• možnost vysokého počtu SRM přechodů (až 600 SRM/s),
• volitelně orthogonální selektivita pomocí FAIMS nebo vysokého rozlišení (HRAM).

Hlavní výsledky a diskuse

Experimenti ukázaly, že zvýšení dwell time:

• nemá významný vliv na maximální intenzitu signálu,
• výrazně zlepšuje stabilitu měření (nižší fluktuace),
• snižuje vliv šumu díky delšímu průměrování dat.

Výpočet S/N se ukázal jako vysoce závislý na zvoleném algoritmu pro odhad šumu (peak-to-peak vs. RMS) i na výběru oblasti pro výpočet šumu, což může vést k až desetkrát odlišným hodnotám. Interscan delay a schopnost rychlého přepínání polarit byly identifikovány jako zásadní pro dosažení vysokého počtu SRMs/s a udržení dostatečného počtu datových bodů (10–15) na chromatografický pik, zejména při úzkých píkových profilech.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace dwell time a zkrácení přepínacích časů umožňuje:

• současnou analýzu stovek analytů v jedné injekci,
• rychlé multi-komponentní screeningové a kvantitativní metody (injekce < 2 min),
• vysoce citlivé detekce stopových množství látek v komplexních matricích,
• zefektivnění laboratorního workflow a úsporu nákladů na analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj MS/MS technik se bude soustředit na:

• integrované iontové mobilitní separace (FAIMS, TIMS) pro zvýšení selektivity,
• další zlepšování iontové optiky a zdrojů pro eliminaci šumu,
• vysokorozlišovací detektory (Orbitrap, TOF) kombinované se SRM režimy,
• pokročilé softwarové nástroje pro automatizovanou optimalizaci a přesný odhad LoD/LoQ.

Závěr

Citlivost LC-MS/MS nelze hodnotit pouze podle poměru signál/šum; je nutné zohlednit i selektivitu, přesnost, opakovatelnost a rychlost akvizice. Optimalizace dwell time a minimalizace interscan delay umožňuje dosáhnout vysokého počtu SRM přechodů za sekundu a zároveň spolehlivou kvantifikaci ve vícenásobných analýzách bez obětování kvality dat.

Reference

1. W.A. Korfmacher: Foundation review: Principles and applications of LC-MS in new drug discovery (2005)
2. J.J. Pitt: Principles and Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Clinical Biochemistry (2009)
3. Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food
4. US EPA Part 136, Appendix B: Method Detection Limit Procedures
5. FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry
6. EMA Guideline on Bioanalytical Method Validation
7. EURL SANTE Guidelines