A quantitative LC-MS/MS method for 15 mycotoxins in corn-based animal feed

Význam tématu

Mykotoxiny představují nebezpečné sekundární metabolity plísní, které se vyskytují v obilovinách během sklizně i skladování. Jejich přítomnost v kukuřičných krmivech ohrožuje zdraví hospodářských zvířat, vede k poklesu výkonnosti a může způsobit značné ekonomické ztráty. Proto je klíčové vyvinout spolehlivou a efektivní analytickou metodu, která umožní rychlou a přesnou kvantifikaci více tříd mykotoxinů současně.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vytvořit robustní kvantitativní postup pro stanovení 15 mykotoxinů v kukuřičném krmivu pomocí LC-MS/MS. Metoda kombinuje jednoduchou extrakci, internalní standardy a přesné SRM sledování, aby se zajistila vysoká přesnost, opakovatelnost a krátký pracovní čas, vhodné pro veterinární diagnostiku.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific TSQ Altis triple quadrupole.
• Kapalinová chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Flex s dvoukanálovým čerpadlem, autosamplerem a ohřevem kolony.
• Chromatografická kolona: Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ 100 × 2,1 mm, 1,9 µm.
• Vortex mixer a centrifugační systémy (Fisher Scientific, Thermo Fisher, Eppendorf).
• Software: Thermo Scientific Xcalibur pro sběr a zpracování dat.

Použitá metodika

Analýza vychází z přístupu „dilute and shoot“. 5 g mletého kukuřičného vzorku se extrahuje 20 mL směsi metanol/voda (70/30) s 0,1 % kyselinou mravenčí. Po 30min vortexu a následné centrifugaci byly vzorky naředěny 1:5, filtrované a injektovány do LC-MS/MS. Kvantifikace probíhala pomocí časovaného SRM režimu, vždy se třemi produktovými ionty na analyta a internal standards pro kompenzaci matričních vlivů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity: Koeficient determinace (R²) pro všechny analyty nad 0,983.
• LLOQ: Rozmezí metod dosahuje 0,5–75 ng/g v závislosti na analytech.
• Recovery: 86–100 % pro jednotlivé mykotoxiny.
• Matriční efekt: Signální potlačení 27–69 % pro většinu analyzovaných látek, zvýšení signálu pro fumonisiny až o 74 %.
• Bias a precize: Všechny analyty vykázaly bias < 15 % na úrovni QC a CV < 15 % včetně LLOQ; příklad robustnosti: Aflatoxin B1 CV 11,3 % při opakované validaci (N=15).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou simultánní analýzu 15 mykotoxinů v kukuřičných krmivech. Díky jednoduché přípravě vzorku a krátké době analýzy (12 min) je vhodná pro rutinní veterinární diagnostiku, kontrolu kvality v potravinářském a zemědělském průmyslu a výzkumné účely.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra analyzovaných toxinů včetně emerging mykotoxinů.
• Automatizace přípravy vzorků pro zvýšení propustnosti laboratoří.
• Integrace s vysokorychlostními MS technikami a HRMS pro široké screeningové studie.
• Využití v monitoringu krmiv dalších obilnin a komplexních směsí.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda s přístupem dilute and shoot nabízí vysoce přesnou, robustní a časově úspornou kvantifikaci 15 mykotoxinů v kukuřičném krmivu. Je plně validována pro veterinární diagnostiku a QA/QC procedury, přičemž splňuje přísné požadavky na citlivost, linearitu a opakovatelnost.

Reference

1. Cheeke PR. Natural toxicants in feeds, forages and poisonous plants. Interstate Publishers, Danville, IL, 1998, s. 87–136.
2. Osweiler GD. Mycotoxins: Contemporary Issues of Food Animal Health and Productivity. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 2000;16(3):511–530.
3. Klaassen CD, Casarett LJ, Doull J. Casarett and Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons. 8th ed. McGraw-Hill, New York, 2013, s. 1139.