Rapid Simultaneous Detection of Respiratory Infectious Diseases using Immunoprecipitation and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Význam tématu

Rychlá a současná detekce více respiračních virových patogenů je zásadní pro efektivní diagnostiku a sledování pandemických i sezónních onemocnění. Imunoprecipitace spojená s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií nabízí selektivní obohacení cílových proteinů a vysokou analytickou citlivost, zaměřenou na vysoce zachovaný nukleokapsidový protein (NP) virů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout zkrácený a vysoce výkonný pracovní postup pro simultánní detekci čtyř respiračních patogenů (SARS-CoV-2, influenzy A a B, RSV, HCoV-229E) v nasofaryngeálních vzorcích s časem přípravy pod 1 hodinu a chromatografickou analýzou během 5 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z následujících kroků:

• Imunoprecipitace: společné zachycení biotinylovaných protilátek na magnetických streptavidinových částicích pro selektivní obohacení NP.
• On-beads trypsinová digesce: 15minutová inkubace při 70 °C pro rychlou a efektivní proteolýzu.
• LC-MS/MS: chromatografie na C18 kolonce Thermo Hypersil GOLD (2,1×50 mm, 1,9 µm) a měření na TSQ Altis MD mass spektrometru.
• Analýza dat: vyhodnocení pomocí TraceFinder LDT softwaru s metrikami LOD, LOQ a lineární dynamikou.

Použitá instrumentace

• Pierce Antibody Biotinylation Kit a MS-Compatible Magnetic IP Kit (streptavidin).
• SMART Digest Trypsin Kit pro rychlou on-beads digesci.
• Vanquish MD HPLC systém se sloupcem Hypersil GOLD C18.
• TSQ Altis MD hmotnostní spektrometr s H-ESI zdrojem.
• Software Thermo TraceFinder LDT 1.0 pro zpracování SRM dat.

Hlavní výsledky a diskuse

V monitorovaném panelu 12 cílových peptidů (2–3 peptidy na virus) bylo dosaženo:

• Limit kvantifikace (LOQ) 0,05–1 fmol na kolonu, limit detekce (LOD) 0,05–0,5 fmol.
• Vynikající linearita se součiniteli R2 > 0,99.
• Variabilita retence ±0,01 min, RSD a CV < 15 % a přesnost ±20 %.
• Celkový čas přípravy vzorku pod 1 hodinu a LC-MS běh 5 minut.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé stanovení čtyř hlavních respiračních patogenů v jednom běhu.
• Odstranění kroků proteinové precipitace díky IP redukuje komplexitu vzorku.
• Vysoká průchodnost a krátký turn-around time vhodný pro klinické i průmyslové laboratoře.
• Možnost adaptace na další obalené viry mající nukleokapsidový protein.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace přípravné části, například použitím robotizovaných stanic KingFisher, což sníží manuální zásahy a zvýší konzistenci. Dále lze rozšířit panel o nové varianty a patogeny či integrovat metodu do sítí rychlé hromadné diagnostiky.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje selektivní imunoprecipitaci a rychlou SRM analýzu pro spolehlivou a citlivou detekci více virových agens. Krátký čas přípravy a analýzy zvyšuje praktickou použitelnost v klinické diagnostice i ve výzkumných laboratořích.

Reference

1. Dutta NK, Mazumdar K, Gordy JT. The Nucleocapsid Protein of SARS–CoV-2: A Target for Vaccine Development. Journal of Virology. 2020;94(13).
2. Heiny AT, Miotto O, Srinivasan KN, et al. Evolutionarily Conserved Protein Sequences of Influenza A Viruses, Avian and Human, as Vaccine Targets. PLoS ONE. 2007;2(11).
3. Centers for Disease Control and Prevention. PREPARATION OF VIRAL TRANSPORT MEDIUM. 2020; dostupné z CDC.