Rapid LC-MS/MS workflow for sensitive quantitation of Metanephrines and 3- Methoxytyramine in human plasma

Význam tématu

Metanefriny (MN, NMN) a 3-methoxytyramin (3-MT) v plazmě představují klíčové biomarkery pro diagnostiku nádorů dřeně nadledvin a poruch katecholaminů. Tradiční metody na bázi HPLC-ECD nebo HPLC-FLD z moči jsou časově náročné a méně specifické, zatímco LC-MS/MS umožňuje rychlé, citlivé a vysoce selektivní stanovení přímo z plazmy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout zkrácený a vysoce citlivý LC-MS/MS workflow pro simultánní kvantifikaci MN, NMN a 3-MT v lidské plazmě a ověřit klíčové metodické parametry: linearitu, přesnost, opakovatelnost, recovery a mezi-denní reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Agilent Ultivo LC/TQ s Agilent Jet Stream ESI; softwary MassHunter Data Acquisition 1.2 a Quantitative 10.0.
• Chromatografie: Agilent Pursuit 3 PFP kolona, desetiminutový gradient vodní fáze a methanolu s 0,1 % formic acid, separace analytů pod 4 min.
• Preparace vzorku: SPE WCX kartridže; 500 µl plazmy s 10 mM NH4H2PO4, pre-kondice, nanesení vzorku, praní vodou/methanolem/acetonitrilem, eluace methanolem s 2 % FA, odpaření, rekonstituce v methanol/voda 5/95 s 0,1 % FA, injekce 20 µl.
• Detekce: MRM přechody pro MN (180.1>165.1), NMN (166.1>134.0), 3-MT (151.1>91.0) a jejich deuterované interní standardy (MN-d3, NMN-d3, 3-MT-d4).

Hlavní výsledky a diskuse

• Baseline chromatografická separace MN, NMN a 3-MT pod 4 min spolu s MRM zajišťuje jednoznačnou identifikaci.
• Citlivost: LOD pro MN-d3 a 3-MT-d4 4 ng/L, LOQ 10 ng/L; pro NMN-d3 LOD 20 ng/L, LOQ 40 ng/L.
• Linearity: korelace R2 > 0,999 pro všechny analyty; přesnost 90–110 % s RSD < 4 %; opakovatelnost plošného signálu RSD < 11 %, retence < 0,3 % RSD.
• Recovery a opakovatelnost: intra-day 90–110 % s RSD ≤ 5 %; inter-day 93–106 % s RSD ≤ 4 %, potvrzující stabilitu SPE a LC/TQ workflow.
• Simultánní analýza metanefrinů a katecholaminů (norepinefrin, epinefrin, dopamin) dokládá univerzálnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá (< 10 min) a citlivá kvantifikace klíčových metabolitů přímo z plazmy.
• Vysoká selektivita díky MRM detekci a PFP chromatografii.
• Spolehlivost a reprodukovatelnost vhodná pro klinické laboratorní i výzkumné aplikace v endokrinologii a onkologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širší spektrum katecholaminových metabolitů a multiplexní panely.
• Automatizace procesu SPE a integrace s robotizovanými platformami pro vysokou propustnost.
• Využití v personalizované medicíně, farmakokinetických studiích a monitorování terapie.

Závěr

Vyvinuté LC-MS/MS workflow kombinuje efektivní SPE čistku, krátkou PFP chromatografii a citlivou MRM detekci pro kvantifikaci MN, NMN a 3-MT v plazmě. Výsledky prokazují vynikající linearitu, přesnost, opakovatelnost a robustnost, což podporuje nasazení v klinické praxi a výzkumu.

Reference

• Agilent application note – Rapid and sensitive quantitation of metanephrines and 3-methoxytyramine in human plasma using an Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS (5994-4729EN).