Evaluation of Fatty Acids Profling in a Blood Drop Spotted on DBS Card by using a Robot-assisted GC Method

Význam tématu

Profil mastných kyselin v krvi představuje cenný ukazatel metabolického stavu, nutričního příjmu a rizika rozvoje civilizačních onemocnění. Použití sušených kapek krve (DBS) usnadňuje odběr vzorku, minimalizuje jeho objem a zjednodušuje skladování a transport. Automatizovaná derivatizační metoda umožňuje rychlou, reprodukovatelnou a vysokoprocesní analýzu mastných kyselin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout plně automatizovaný postup pro stanovení mastných kyselin v jediné kapce krve nanesené na DBS karty. Metoda kombinuje robotickou přípravu vzorku, přímou derivatizaci molekul do metylesterů a analýzu pomocí plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) a FID detekcí na iontovém kapalinném sloupci.

Použitá metodika

Vzorek krve získaný z prstu byl nanesen na Whatman 903 DBS kartu, vysušen 60 minut a vystřižen do skleněné vialky. Derivatizace probíhala na robotické stanici AOC-6000: nejprve přidání methanolického roztoku NaOMe (0,5 %), promíchání a zahřátí (95 °C), následně BF₃ v methanolu (14 %) za stejných podmínek. Extrakce FAME proběhla heptanem a separací fází. Analyty byly separovány na SLB-IL60 (30 m × 0,25 mm × 0,20 µm) v programu 70 → 180 °C (3 °C/min, 10 min izotermie) → 280 °C (3 °C/min) a detekovány GC-MS (full scan 40–550 amu) a FID.

Použitá instrumentace

• DBS karty Whatman 903
• Robotická stanice AOC-6000 (Shimadzu)
• GC-MS/FID Nexis GC-2030 s TQ8050 NX
• Iontový kapalinný sloupec SLB-IL60
• GC-3 SilFlow port splitter

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci a kvantifikaci 31 mastných kyselin. Obsah SFA činil 37,1 %, MUFA 27,5 % a PUFA 35,4 %. Dominujícími složkami byly kyselina palmitová (23,2 %) a olejová (23,6 %). Poměr omega-6/omega-3 dosáhl 14,5. Iontový kapalinný sloupec zlepšil rozlišení dvojitých vazebních izomerů, zatímco kombinace MS spektroskopie (>85 % podobnost) a LRI (±10) zajistila jednoznačnou identifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný postup snižuje lidské chyby, spotřebu reagencií a zvyšuje propustnost vzorků. Díky DBS odběru lze provádět velkoobjemové populační či klinické studie bez náročné logistické podpory. Metoda nachází uplatnění v nutričním, metabolickém i farmaceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je tvorba kvantitativních databází referenčních profilů mastných kyselin pro zdravé a nemocné populace. Integrace vysoce citlivé MS/MS analýzy a rozšíření na další lipidové třídy (fosfolipidy, ceramidy) podpoří diagnostiku a personalizovanou medicínu. V perspektivě jsou také bodové diagnostické přístroje pro rapidní screening v terénu.

Závěr

Představená roboticky asistovaná metoda pro přímou derivatizaci a GC analýzu FAME z DBS karet nabízí robustní, rychlý a přesný přístup k lipidovému profilování. Je ideální pro velké studie a má potenciál v klinických aplikacích a vývoji terapeutických strategií.

Reference

1. Bondia-Pons I, Castellote IA, López-Sabater MC. J Chromatogr B. 2004;809:339–44.
2. Christie WW, Han X. Lipid analysis. 4th ed. Oily Press; 2010.
3. Fanali C, Micalizzi G, Dugo P, Mondello L. Analyst. 2017;142:4601–12.
4. Ferreri C, Chatgilialoglu C. Membrane Lipidomics for personalized health. John Wiley & Sons; 2015.
5. Firl N et al. Clin Chem Lab Med. 2013;51:799–810.
6. Galli C et al. World Rev Nutr Diet. 2009;100:35–45.
7. Metcalfe LD, Schmitz AA. Anal Chem. 1966;38:514–5.
8. Micalizzi G et al. Anal Bioanal Chem. 2020;412:2327–2337.
9. Morrison WR, Smith LM. J Lipid Res. 1964;5:600–8.
10. Rizzo AM et al. Lipids Health Dis. 2010;9:1–8.
11. Tranchida PQ et al. J Sep Sci. 2008;31:3347–51.