Sample Preparation by Mixed-Mode SPE Using ISOLUTE® HCX

Význam tématu

Metoda přípravy vzorku založená na mixed-mode SPE s použitím sorbentů ISOLUTE HCX představuje efektivní přístup k extrakci základních léčiv z biologických tekutin. Tato technika kombinuje nepolární a kationtovou výměnnou interakci, čímž dosahuje vysoké selektivity a čistoty extraktu. Pro nízkoúrovňovou analýzu (LC-MS, HPLC) je klíčové minimalizovat množství přítomných interferencí a snížit matrixové efekty na detekci analytů.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky bylo demonstrovat protokol pro přípravu vzorku biologických tekutin (plazma, moč) o objemu 100 μL s využitím 25 mg/1 mL mixed-mode SPE kolonek ISOLUTE HCX. Studie ukazuje kompletní pracovní postup od úpravy vzorku až po eluci analyzovaných látek, včetně optimalizace podmínek pro selektivní odstranění nežádoucích matriceových složek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a extrakci byla použita následující zařízení a spotřební materiál:

• ISOLUTE HCX mixed-mode SPE kolony (25 mg/1 mL) a 96well destičky
• Vakuační/manifoldu systémy VacMaster-10/20 nebo VacMaster-96
• Biotage PRESSURE+96 pozitivně tlakový manifold
• Automatizovaný liquid handling Biotage Extrahera™

Klíčové kroky postupu:

1. Úprava vzorku: 1:1 ředění vzorku (100 μL plazmy/moč + 100 μL 0,05 M NH4Ac bufru pH 6,0).
2. Kondicionace kolony: 1 mL methanolu.
3. Equilibrace: 250 μL 0,05 M NH4Ac pH 6,0.
4. Naložení vzorku: 200 μL ředěného vzorku.
5. Eluce interferencí: 250 μL 0,05 M NH4Ac pH 6,0; 250 μL 1 M acetic acid; 250 μL methanolu.
6. Eluce analytů: 2×100 μL 95:5 methanol/NH4OH, s prosycháním a namočením.
7. Koncentrace a re-konstituce extraktu pro analytickou techniku (LC-MS, HPLC).

Hlavní výsledky a diskuse

Protokol umožnil extrahovat základní léčiva bez průniku neionizovatelných složek až ze 100 μL biologického vzorku bez průniku analyzátu. Mixed-mode sorbenty zajišťují nezávislou retenci jak nepolárních, tak kationtových látek, což umožňuje cílenou eluci interferencí a následné čisté uvolnění analytů. Výsledné extrakty vykazovaly nízkou míru matrixových efektů a vysokou reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda přináší následující výhody:

• Vysoká čistota extraktu s minimálními matricovými interferencemi.
• Robustnost vůči proměnlivé ionické síle vzorku.
• Možnost práce s malými objemy vzorku (100–200 μL).
• Kompatibilita s automatizovanými platformami pro vysokoprůtokové analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směruje k dalšímu zvyšování automatizace a integraci online SPE systémů do LC-MS pracovních postupů. Očekávají se také nové sorbenty s upravenou chemickou funkcionalitou pro širší rozsah analyzů a matrice. Další perspektivou je miniaturizace protokolů pro mikro-SPE formáty a jejich kombinace s kapilárními systémy.

Závěr

Mixed-mode SPE na sorbentech ISOLUTE HCX nabízí selektivní, reprodukovatelný a vysoce čistý přístup k extrakci základních léčiv z biologických tekutin. Díky kombinaci nepolárních a iontových interakcí je možné efektivně odstranit rušivé látky a získat analyty připravené pro citlivou analýzu.

Reference

• Biotage. Sample Preparation by Mixed-Mode SPE Using ISOLUTE HCX. Technical Note TN125.V.1, 2020.