Extraction of a Comprehensive Steroid Panel from Horse Hair Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC/MS-MS Analysis

Význam tématu

Stanovení steroidních hormonů ve vlasech koní nabízí dlouhodobou retrospektivu expozice a je klíčové ve veterinární toxikologii, dopingové kontrole a v hormonální diagnostice. Vysoce citlivé a reprodukovatelné metody extrakce a analýzy zajišťují spolehlivé výsledky i při nízkých hladinách analytů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit rychlý postup přípravy vzorků pro extrakci 18 steroidů z koňských vlasů za použití SLE+ desek ISOLUTE, následované UHPLC-MS/MS analýzou. Studie demonstruje vysoké výtěžky analýzy, nízké rozptyly a vynikající lineární odezvu v rozsahu 0,5–500 pg/mg.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Vážené vlasy (20 mg) v Biotage Lysera trubicích s nerezovými kuličkami.
• Dvoufázová mikropulverizace: nejprve 5×6,45 m/s 45 s v 0,1 % NH4OH v IPA, poté 3×5,3 m/s 60 s.
• Spike interními standardy (DHT-D3, Aldosterone-D4) pro cílovou koncentraci 50 pg/mg.
• Centrifugace 13 300 rpm, naložení 200 µL extraktu přímo na ISOLUTE SLE+ 400 µL desku.
• Eluce dvěma 500 µL porcemi dichlormetanu za gravitace a na závěr pod tlakem 10 psi.
• Evaporační sušení při 40 °C, 20–40 L/min, reconstituce v mobile fázi A/B 1:1 (200 µL).

Instrumentace:

• UHPLC: Shimadzu Nexera X2 s kolonkou ACE C18 (100×2,1 mm, 1,7 µm), teplota 40 °C, průtok 0,4 mL/min, injekce 5 µL.
• Mobilní fáze A: 0,2 mM NH4F(voda), B: methanol; gradient od 50 % A do 5 % A v 9 min.
• MS/MS: Shimadzu 8060, ESI v positivním i negativním módu dle analytu, MRM přechody s kolizní energií optimalizovanou pro každý steroid.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průměrné výtěžky extrakce >80 % a RSD <5 % pro většinu steroidů.
• Lineární odezva r2 >0,999 v rozsahu 0,5–500 pg/mg.
• Mezní koncentrace (LLOQ) od 0,5 do 25 pg/mg, nejnižší hodnoty 0,5–1 pg/mg u klíčových hormonů.
• Chromatografie umožnila dostatečné rozlišení isobarických sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a reprodukovatelný postup bez emulzí ve formátu 400 µL desek.
• Možnost současné analýzy širokého spektra steroidů s vysokou citlivostí.
• Využití v dopingové kontrole, forenzních a klinických studiích zaměřených na hormonální profilaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o další steroidní metabolity.
• Automatizace postupu v 96well platformě pro vyšší throughput.
• Úpravy mobilní fáze a ionizace pro zlepšení citlivosti a selektivity.
• Aplikace ve veterinární medicíně i lidské klinické diagnostice.

Závěr

Navržená metoda extrakce pomocí ISOLUTE SLE+ poskytuje čisté extrakty se stabilními a vysokými výtěžky, nízkými mezemi detekce a vynikající lineární odezvou. Je vhodná pro rutinní analýzu steroidních hormonů ve vlasech koní.

Reference

Biotage Application Note AN921: Extraction of a Comprehensive Steroid Panel from Horse Hair Using ISOLUTE SLE+, Biotage AB, 2019.