Analyses of Antibody Drugs Using Ultra HighPerformance Liquid Chromatography

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) a konjugáty protilátka-léčivo (ADC) patří mezi klíčové bioterapeutické přípravky díky vysoké selektivitě a terapeutické účinnosti. Pro zajištění bezpečnosti a konzistence účinku je nezbytné provádět detailní kontrolu kvality, zejména stanovení a kvantifikaci souvisejících nečistot, multimerů, degradátů, izomerů a poměru navázaných drogových molekul. Ultra vysokovýkonná kapalinová chromatografie (UHPLC) s inertními komponentami poskytuje stabilní a reprodukovatelná data i za použití vysoce korozivních mobilních fází obsahujících koncentrace solí potřebné pro separaci těchto komplexních vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je představit analytické postupy pro kontrolu kvality mAb a ADC s využitím inertního UHPLC systému Nexera XS inert od Shimadzu. Autoři demonstrují:

• Optimalizaci separace agregátů a degradátů metodou velikostní exkluze (SEC).
• Potlačení nežádoucích interakcí při analýze ADC pomocí modifikace mobilní fáze (HIC/SEC).
• Oddělení a kvantifikaci nábojových variant protilátek pomocí iontově výměnné chromatografie (IEX).
• Stanovení poměru drogových molekul navázaných na protilátku (DAR) pomocí chromatografie na bázi hydrofobní interakce (HIC).

Použitá instrumentace

Pro všechny analýzy byl použit systém Nexera XS inert vybaven:

• UV detektor SPD-M40 s inertní průtokovou celou pro stabilní detekci při 280 nm.
• Rozdílné kolony TSKgel pro jednotlivé chromatografické režimy: UP-SW3000/UP-SW2000 (SEC), CM-STAT (IEX), Butyl-NPR (HIC) aj.
• TORAST™-H skleněné vialy pro vzorky.

Hlavní výsledky a diskuse

• SEC analýza mAb: za izokratických podmínek na TSKgel UP-SW3000 dochází k rozlišení multimeru, monomeru a degradátů během 5 minut. ADC bez úpravy mobilní fáze vykazuje rozmazání píků vlivem hydrofobních interakcí.
• Potlačení hydrofobní interakce v SEC/ADC: přidání 15 % 2-propanolu do mobilní fáze vedlo k ostrým a dobře rozlišeným píkům ADC konjugátů.
• IEX analýza nábojových variant mAb: na kolóně TSKgel CM-STAT byly gradientně odděleny kyselé i bazické varianty u tří typů mAb (humanizovaná protilátka, NIST mAb, cetuximab) s četnými rozlišitelnými píků.
• HIC stanovení DAR: gradientní program na TSKgel Butyl-NPR umožnil rozdělit ADC s různým počtem navázaných malých molekul (DAR 0–6) bez předběžné úpravy vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká reprodukovatelnost a stabilita výsledků i při vysoké koncentraci solí.
• Rychlé analýzy s partnerskými kolónami pro různé typy nečistot a modifikací protilátek.
• Možnost flexibilní optimalizace mobilních fází (např. přidání organických modulátorů) pro potlačení nežádoucích interakcí.
• Jednotné platformy pro QC laboratoře ve farmacii a bioprodukci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se soustředí na:

• Integraci UHPLC s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) pro detailní charakterizaci PTM (post-translačních modifikací).
• Automatizaci přípravy vzorků a multiplatformní analýzu v reálném čase pro on-line procesní monitoring (PAT).
• Vyšší dimenzionalitu chromatografie (2D-LC) pro komplexní rozlišení vzájemně se ovlivňujících variant.

Závěr

Inertní UHPLC systém Nexera XS inert prokázal svoji schopnost poskytovat vysoce kvalitní a reprodukovatelná data pro analýzy mAb a ADC včetně separace agregátů, nábojových variant a stanovení DAR. Díky odolnosti vůči korozivním mobilním fázím lze optimalizovat chromatografické podmínky pro rozmanité bioterapeutické látky a zajistit robustní QC postupy ve farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.
2. Ministry of Health, Labour and Welfare (Japonsko), PFSD/ELD Notification No. 571, 2001.
3. Biopharmaceutical Handbook, 4th Edition, Jiho Inc.
4. Arakawa T., Ejima D., Tsumoto K., Gagnon P., Solvent modulation of chromatography, Journal of Japanese Biochemical Society, 80(1):45–51.