Selection of Peptide Targets for Species-independent Quantitation of Fish Allergens

Význam tématu

Detekce a kvantifikace stop rybích alergenů v potravinách je klíčová pro ochranu spotřebitelů s alergií na ryby. Široká diverzita konzumních druhů ryb vyžaduje univerzální analytické cíle, které jsou konzervované ve více druzích, kvantitativně srovnatelné a selektivní vůči rybím proteinům.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie se zaměřovala na:

• Stanovení vhodnosti kvantifikace hlavních alergenů (parvalbumin, enoláza, aldoláza) pro širokospektrální detekci ryb.
• Identifikaci peptidů přítomných napříč 9 významnými druhy ryb s podobnou abundancí a exkluzivními pro rybí proteiny.
• Vytvoření metodického postupu pro následnou selekci peptidových cílů pro kvantitativní analýzu reziduí ryb v potravinách.

Použitá metodika

Vzorky masa 9 druhů ryb (treska, pollock, sledě, losos, tuňák, rejnok, tilapie, chňapal, mořský vlk) byly odebrány ve třech biologických replikátech. Proteiny se extrahovaly redukčním ureovo-thiourea protokolem (6 M ureum, 2 M thiourea, 50 mM Tris-HCl pH 8.6, 50 mM DTT). Pro neselektivní (label-free) kvantifikaci byly provedeny tři technické replikáty měření.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Q Exactive HF
• UPLC systém Thermo Scientific UltiMate 3000 nanoRS
• Kolonka Waters Acquity UPLC M-Class Peptide CSH C18 130 Å, 1.7 µm, 75 µm × 250 mm

Hlavní výsledky a diskuse

• Parvalbumin: Detekováno 51 peptidů z 14 izoform. Rozdíl abundancí až 6-násobně mezi druhy; pouze 4 izoformové rodiny byly konzistentní napříč všemi druhy. Kvůli vysoké variabilitě nebyl parvalbumin ideální analytický cíl.
• Enoláza: 94 peptidů ze 6 izoform. Variabilita abundancí až 11-násobná, což komplikuje univerzální kvantifikaci.
• Aldoláza: 63 peptidů ze 7 izoform. Rozdíl abundancí až 10krát.
• Z ~200 peptidů s koeficientem variace pod 150 % splňovalo kritéria rybí specifičnosti po BLAST P jen 25 % kandidátů, většina pocházela ze svalových proteinů mimo hlavní alergeny.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow umožňuje selekci peptidů konzervovaných napříč druhy s nízkou variabilitou a vysokou specifičností vůči pekařským (sic) – potravinovým produktům. Vybrané peptidy lze aplikovat v cílených MRM/PRM metodách pro rutinní screening kontaminace rybími proteiny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace vybraných peptidových cílů do PRM metod pro kontrolu potravinářských výrobků.
• Rozšíření přístupu na další potravinové alergeny a druhy živočišných proteinů.
• Využití podobného workflow pro environmentální monitoring a zkoumání genetické diverzity rybích populací.

Závěr

DDA-based strategie pro výběr peptidových cílů je validní a adaptovatelná na napříč-druhové studie. Parvalbumin nevykazuje dostatečnou konzistenci pro širokospektrální kvantifikaci. Byla identifikována omezená skupina univerzálních peptidů vhodných pro vysoce spolehlivé kvantitativní metody v potravinové analýze.

Reference

• Marsh J. T., Yang C., Johnson P. Selection of Peptide Targets for Species-independent Quantitation of Fish Allergens. University of Nebraska-Lincoln & Thermo Fisher Scientific; 2023.
• Clustal Omega: Multiple Sequence Alignment Tool.