Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography: Some Aspects of Solvent and Column Selectivity

Význam tématu

Hydrophilní interakce kapalina-kapalina (HILIC) představuje účinný přístup k separaci malých polar­­ních a hydrofilních sloučenin, u kterých bývá u konvenčních reverzních fází obtížné dosáhnout dostatečné retence bez použití iontových párů či silných pufrů. HILIC nabízí vyšší retenci těchto analy­­tů při zachování kompatibility s hmotnostní spektrometrií díky mobilní fázi s vysokým podílem organického rozpouštědla a vodnou vrstvou na povrchu stacionární fáze.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotila retenční mechanismy pěti různých HILIC stacionárních fází (Accucore HILIC, Hypersil GOLD HILIC, Syncronis HILIC, Hypersil GOLD Silica, Hypercarb) při separaci dvou modelových směsí malých polar­­ních sloučenin (základní a kyselinová). Zkoumaly se vlivy obsahu acetonitrilu, teploty kolony a koncentrace pufru na retenci a selektivitu, aby se usnadnil vývoj a optimalizace HILIC metod.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• HPLC systém s kvaternárním čerpadlem, degaserem, DAD detektorem, ohřívací jednotkou kolony a autosamplerem
• Tok: 1,0 mL/min; objem injekce: 5 μL; teplota kolony: 30 °C; detekce UV při 248 nm (základní směs) a 228 nm (kyselinová)

Testovací směsi:

• Základní: uracil, adenosin, uridin, cytosin, cytidin
• Kyselinová: salicylamid, salicylová kyselina, aspirin, 3,4-dihydroxyfenylacetic acid (dhpa)

Mobilní fáze: acetonitril/voda (90/10, v/v) s 10 mM ammonium acetatem (pH ~6,7)
Stacionární fáze:

• Syncronis HILIC 100×4,6 mm, 5 μm, plocha 320 m2/g, póry 100 Å
• Hypersil GOLD HILIC 100×4,6 mm, 5 μm, plocha 220 m2/g, póry 175 Å
• Hypersil GOLD Silica 100×4,6 mm, 5 μm, plocha 220 m2/g, póry 175 Å
• Accucore HILIC 100×4,6 mm, 2,6 μm, plocha 130 m2/g, póry 80 Å
• Hypercarb (PGC) 100×4,6 mm, 5 μm, plocha 120 m2/g, póry 250 Å

Hlavní výsledky a diskuse

• Mezi stacionárními fázemi byly zřejmé výrazné rozdíly v retenci a selektivitě, což dokládá, že kromě hydrophilního vzájemného rozdělení se uplatňují i sekundární elektrostatické a iontové interakce.
• Syncronis HILIC vykázal nejvyšší retenci díky vyšší ploše a slabým elektrostatickým interakcím nezávislým na pH.
• Hypersil GOLD HILIC (polyetyléniminový ligand) prokazoval silné iontově-výměnné interakce zejména se slabými kyselinami, jejichž retence klesala s narůstající koncentrací pufru.
• Hypercarb (porézní grafitický uhlík) kombinoval disperzní interakce s indukovanými nábojovými interakcemi, což vedlo k hybridnímu chování (HILIC i RP) v závislosti na podílu acetonitrilu.
• Změna procenta acetonitrilu potvrdila klasický pokles retence při nižších podílech organiky pro většinu fází, ovšem na PGC a některých fázích se objevovalo netypické chování.
• Van’t Hoffova analýza prokázala u většiny fází exothermní retenci (negativní entalpie), zatímco u Hypercarb a Hypersil GOLD HILIC byla entalpie kladná, indikující endothermní proces a kombinaci mechanismů.
• Zvýšení koncentrace pufru obvykle posílilo retenci (hydrophilní partitioning model), ale u fází s iontově výměnnými skupinami docházelo k potlačení retenční síly slabých kyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Efektivní separace vysoce polarních analytů bez potřeby silných iontových párů
• Kompatibilita s hmotnostní spektrometrií a lepší rozpustnost vzorků
• Rychlejší vývoj a optimalizace HILIC metod díky pochopení klíčových parametrů
• Možnost jemného ladění selektivity výběrem vhodné stacionární fáze

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových bifunkčních stacionárních fází kombinujících iontové a hydrophilní mechanismy
• Pokročilé modelování retenčních procesů a predikční softwarová řešení
• Automatizace optimalizace metod za využití multivariačních a strojového učení
• Integrace HILIC s vysokorozlišovací MS a dalšími detektory pro komplexní analýzy

Závěr

Komplexní srovnání pěti HILIC fází potvrdilo zásadní roli kromě hydrophilního rozdělení také elektrostatických a iontových interakcí. Optimalizace složení mobilní fáze, teploty a koncentrace pufru je klíčová pro dosažení požadované retence a selektivity.

Reference

1. A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 17
2. Y. Guo a S. Gaiki, J. Chromatogr. A, 1074 (2005) 71
3. P. Hemstrom a K. Irgum, J. Sep. Sci., 29 (2006) 1784