Reliable High Resolution Protein SEC Separations for Online Native LC-MS mAb Analysis

Význam tématu

Velmi přesná analýza proteinových therapeutik, zejména monoklonálních protilátek (mAb), vyžaduje metodiku, která zachová jejich nativní strukturu a současně umožní hlubokou charakterizaci velikostních variant. Nativní LC-MS spojená s chromatografií vyměšovací na velikosti (SEC) nabízí jednoduché, rychlé a entropicky řízené oddělení bez silné interakce proteinu s povrchem kolony. Klíčovým požadavkem je však minimalizovat sekundární interakce, zejména při používání MS-kompatibilních mobilních fází založených na amonném acetátu.

Cíle a přehled studie

Tato studie si klade za cíl ověřit výkonnost nové technologie SEC kolony ACQUITY Premier a XBridge Premier Protein SEC 250 Å vybavené hydroxy-ukončenými PEO ligandy a hydrofobně-hydrofilními povrchy MaxPeak HPS při provádění online nativní LC-MS mAb analýz. Hlavními cíli jsou:

• Ověřit snížení nežádoucích iontových a hydrofobních interakcí mezi analyty a povrchem kolony.
• Zlepšit detekční limity, symetrii píků a recoveri analytů při nízkých koncentracích amonného acetátu.
• Demonstrace aplikace pro rutinní charakterizaci agregátů a fragmentů monoklonálních protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byly použity kolony:

• ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å, 1,7 μm (4,6×150 mm)
• XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2,5 μm (4,6×150 mm)
• Komparativně BEH SEC 200 Å kolona s diol povrchem

Mobilní fáze sestávala z amonného acetátu připraveného pomocí IonHance CX-MS koncentrátů (pH 5 → 50 mM; pH 8,5 → 160 mM). Optimální poměr byl 40 : 60 A/B pro celkem 116 mM amonného acetátu s 2 % ACN.
LC podmínky: UPLC I-Class, TUV detektor 280 nm, 0,2 mL/min, T 30 °C, inj. objem 7,5 µL.
MS: BioAccord RDa (400–7000 m/z, 1,5 kV) a Xevo G2-XS QTof (400–9000 m/z, 2,5 kV), pozitivní ionizace.

Hlavní výsledky a diskuse

- Detekční limity: XBridge Premier kolona umožnila UV detekci mAb až do 37,5 ng injikovaného proteinu s vysoce symetrickými píky.
- Iontová síla: ACQUITY Premier funguje stabilně již od 50 mM amonného acetátu, zatímco běžné diol-BEH kolony vykazují výrazné deformace píku a nedostatečné rozlišení při ≤ 50 mM.
- MS integrace: Pro potlačení nízkomolekulárních background iontů z PEO je doporučeno nastavit dolní hranici akvizičního okna ≥ 1000 m/z. Při širším rozsahu lze detekovat i HMW agregáty.
- Reprodukovatelnost: Po 250 opakovaných injekcích Intact mAb Standard s BioAccord RDa byly získány RSD 2,9 % (MS XIC) a 3,0 % (UV), což dokládá vysokou stabilitu výkonu kolony.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení citlivosti a reprodukovatelnosti nativního SEC-MS pro mAb screening i QA/QC.
• Zachování nativní struktury analyzovaného proteinu umožňuje přesnější stanovení agregátů a fragmentů.
• Rychlá online desalting a minimalizace přípravných kroků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace PEO-bondovaných kol, hydrofobně-hydrofilních povrchů a optimalizovaných mobilních fází otevírá nové možnosti pro:

• Vyšší průtokové platformy s menšími ID kolony při zachování MS citlivosti.
• Pokročilé charakterizace komplexů protein-ligand a multi-proteových agregátů.
• Automatizované workflow pro vysokopropustný screening fragmentových knihoven.

Závěr

Vyvinutá technologie SEC kol ACQUITY Premier a XBridge Premier Protein SEC 250 Å s PEO povrchy a MaxPeak HPS výrazně snižuje sekundární interakce, zlepšuje tvary píku, recoveri a citlivost při nativní LC-MS analýze mAb. Metoda je robustní, reprodukovatelná a vhodná pro rutinní charakterizaci proteinových terapeutik.

Reference

1. Farsang E. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 185, 113207.
2. Murisier A. et al., J. Chromatogr. A 2021, 1655, 462499.
3. Chen B. et al., Anal. Chem. 2016, 88(3), 1885–1891.
4. Lauber M. A., The Analytical Scientist 2019.
5. Goyon A. et al., J. Chromatogr. B 2017, 1065–1066, 35–43.
6. Shion H. et al., Waters Application Note 720006529EN.