Analysis of Adenoviral Vector Proteins by RPLC, Native Fluorescence, and Online MS

Význam tématu

Adenovirusové vektory představují jednu z nejrozšířenějších platforem pro dodávku genů ve vakcínách i genových terapiích. Díky schopnosti nést velké transgeny, absenci integrace do hostitelského genomu a možnosti připravy replikace neschopných částic poskytují adenoviry efektivní a relativně bezpečnou cestu pro in vivo aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a ukázat metodiku RPLC separace proteomu lidského adenoviru 5 (HuAdV5) s použitím difluoroacetic acid (DFA) ion pairing a 2,7 µm superficially porous fenylového gelu. Metoda byla optimalizována pro přímou analýzu vzorku bez předúpravy a kombinovala nativní fluorescenci s on-line IMS QTof MS pro stanovení kopiových poměrů a intaktních hmotností proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: HuAdV5 GFP (-E1/-E3, 1×10¹² pfu/mL) injikován přímo do chromatografu bez přípravy.
Chromatografie:

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System
• Kolona BioResolve RP mAb Polyphenyl 450 Å, 2,7 µm, 2.1×150 mm
• Teplota kolony 80 °C, průtok 0,4 mL/min, gradient 10–50 % ACN v 0,1 % DFA, doba běhu 20 min

Detektory:

• ACQUITY UPLC FLR (Ex 280 nm, Em 360 nm, 20 Hz)
• Vion IMS QTof (ESI+, 1000–4000 m/z, desolvace 650 °C, cone gas 300 L/h, desolvation gas 1200 L/h)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vysoké vrcholové kapacity (200–480) a citlivosti v širokém rozsahu množství proteinů. Identifikována byla například:

• Protein VI – 22 100 Da, cementní protein s vysokým kopiovým číslem.
• Protein IX – 14 369 Da, cementní protein s možnou posttranslační modifikací (Δ42 Da).
• Hexon (protein II) – ~107 899 Da, hlavní stavební prvek kapsidy, 720 kopií na částici.

Použití DFA minimalizuje iontovou supresi typickou pro TFA a umožňuje kvalitní on-line dekonvoluci intact mass dat.

Přínosy a praktické využití metody

Propojení RPLC s DFA ion pairing a on-line MS umožňuje:

• Přímou analýzu formulovaného vektoru bez dodatečné úpravy.
• Vysokou chromatografickou separaci s širokým dynamickým dosahem.
• Přesné stanovení intaktních molekulových hmotností a kopiových poměrů proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této metodiky na další adenovirusové serotypy a nehumánní vektory. Integrace s pokročilou top-down proteomikou umožní hlubší studium posttranslačních modifikací a heterogenity. Adaptace na UHPLC systémy a automatizace analýzy podpoří rutinní QC genových terapií.

Závěr

Navržený RPLC postup s DFA a superficiálně pórovým fenylovým materiálem poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu intact proteinů adenovirusových vektorů. Kombinace nativní fluorescence a on-line IMS QTof MS umožňuje komplexní charakterizaci proteomu, což usnadní vývoj, optimalizaci a kontrolu kvality vakcín i genových terapií.

Reference

1. Goswami R. et al. Gene Therapy Leaves a Vicious Cycle. Front Oncol. 2019;9:297.
2. Mennechet FJD et al. Review of 65 Years of Adenovirus Seroprevalence. Expert Rev Vaccines. 2019;18(6):597–613.
3. Lee CS et al. Adeno Virus-Mediated Gene Delivery. Genes Dis. 2017;4(2):43–63.
4. Reddy VS, Nemerow GR. Adenovirus Cement Proteins. PNAS. 2014;111(32):11715–11720.
5. Ahi YS, Mittal SK. Components of Adenovirus Genome Packaging. Front Microbiol. 2016;7:1503.
6. Van Tricht E. et al. Protein Profiling of Adenovirus Vaccines by UPLC. J Chromatogr A. 2018;1581–1582:25–32.
7. Bobály B. et al. Characterizing Monoclonal Antibodies s mírnými podmínkami. J Chromatogr B. 2018;1096:xxx–xxx.
8. Nguyen JM et al. LC-MS Profiling of ADCs with DFA Ion Pairing. mAbs. 2019;11(8):1358–1366.