Automated method development in HPLC for the quantitative determination of catechins in tea

Význam tématu

V posledních letech roste zájem o potraviny a nápoje podporující zdraví díky vysokému obsahu biologicky aktivních látek. Čaj je nejrozšířenějším nápojem na světě a jeho bioaktivní složkou jsou zejména katechiny s významným antioxidačním efektem. Stanovení přesného obsahu katechinů v různých typech čaje (bílý, zelený, černý) pomáhá lépe porozumět jejich nutriční hodnotě a vlivu na lidské zdraví.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout jednoduchou, rychlou a citlivou metodu HPLC s UV detekcí pro kvantifikaci sedmi hlavních katechinů v nálevu z čajových sáčků. Metoda zahrnovala kompletní automatizované navrhování chromatografických podmínek pomocí softwaru ChromSwordAuto 5, od výběru vhodné kolony a mobile fáze až po optimalizaci gradientu eluce.

Použitá metodika

Pro metodu bylo provedeno:

• Příprava standardů katechinů (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GC, GCG) ve 50 % acetonitrilu.
• Automatizované vyhledání optimální kolony a mobilních fází: testováno 4 stacionární fáze a 4 akvauzní eluenty v kombinaci s acetonitrilem a methanolem.
• Rapidní optimalizace: screening 69 metod pro výběr nejlepšího chromatografického systému.
• Jemná optimalizace (sample profiling): doladění gradientu za přítomnosti reálné matrice (zelený čaj) k odstranění koelucí a zlepšení čistoty píku.
• Kvantifikace: kalibrace externími standardy v rozmezí 1–100 µg/mL, stanovení LOD a LOQ extrapolací ze S/N poměru.
• Příprava vzorků: příprava čajového nálevu podle doporučené doby louhování, filtrace 0,2 µm a ředění (1:5, 1:10, 1:20).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RS HPLC systém: LPG-3400RS pumpa, SRD-3400 solvent rack s 4 oddegazovaliči, WPS-3000TRS vzorkovač, TCC-3000RS termostat sloupce, DAD-3000RS UV/VIS detektor.
• Software ChromSwordAuto 5 (moduly Scout, Developer, ReportViewer) pro automatizované navrhování a vyhodnocení metod.
• Chromeleon CDS 7.2.8 pro akvizici a kvantitativní zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Rapidní optimalizace prokázala, že nejlepší separace sedmi katechinů je na termostatované kolóně Accucore Phenyl-X (100×3 mm, 2,6 µm) s mobile fází 20 mM acetátového pufru pH 3,8 a acetonitrilem. Kritický pár EGCG/GC dosahoval rozlišení >3,8 a nejmenší šířku píků <0,03 min. Po jemné optimalizaci se odstranila koeluce EGC s matricí, čistota píku EGCG vzrostla z 0,897 na 0,959. Celková doba analýzy se prodloužila na 15,4 min, separace v rámci 12 min.
Linearity kalibrace byla vynikající (R2 = 0,9984–0,9995). LOD se pohybovalo v rozmezí 0,1–2,5 µg/mL, LOQ 0,2–8 µg/mL. Obsahy katechinů v jednom šálku (200 mL) byly nejvyšší u zeleného čaje (107 mg), u bílého střední (53 mg) a nejnižší u černého (4 mg). EGCG a EGC dominovaly u bílého a zeleného čaje, GC u černého.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení laboratorního času pro vývoj chromatografické metody.
• Standardizované a reprodukovatelné podmínky díky softwarové automatizaci.
• Vysoká selektivita a citlivost pro stanovení biologicky aktivních katechinů v reálných vzorcích.
• Možnost rutinního nasazení v potravinářské, farmaceutické i výzkumné praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace vývoje chromatografických metod bude nadále sbližovat analytickou chemii s oblastí umělé inteligence a strojového učení. Dalšími směry jsou rozšíření metod na více sloučenin (např. polyfenoly, alkaloidy), integrace s hmotnostní spektrometrií a minimalizace spotřeby organických rozpouštědel ve smyslu zelené chemie.

Závěr

Softwarově řízené vyvinutí HPLC metody pomocí ChromSwordAuto 5 na UltiMate 3000 přineslo vynikající separaci sedmi katechinů v čajových nálevech během několika dnů. Metoda je citlivá, přesná a snadno přenositelná pro rutinní analýzy v oblasti potravinové kvality a výzkumu antioxidantů.

Reference

1. Neves MF, Trombin VG, Lopes FF, Kalaki R, Milan P. World consumption of beverages. In: The Orange Juice Business. Wageningen Academic Publishers; 2011. doi:10.3920/978-90-8686-739-4_31
2. Mohan M, Jeevanandan G, Raja SM. The role of green tea in oral health – A Review. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 2018;11(4):1. doi:10.22159/ajpcr.2018.v11i4.23628
3. Zuo Y, Chen H, Deng Y. Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallic acids in green, Oolong, black and pu-erh teas using HPLC with a photodiode array detector. Talanta. 2002;57:307–316.
4. Thermo Fisher Scientific. Sensitive Determination of Catechins in Tea by HPLC. Application Note 275; 2018.