High-Throughput Peptide Mapping with the Vanquish UHPLC System and the Q Exactive HF Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčové bioterapeutikum s komplexními strukturními modifikacemi, které ovlivňují jejich účinnost a stabilitu. Vysoce výkonná metoda peptide mappingu s krátkými chromatografickými běhy umožňuje rychlou identifikaci a kvantifikaci statických i dynamických post-translačních modifikací (glykozylace, oxidace, deamidace, sekvenční zkraty) nezbytnou pro kontrolu kvality a vývoj biopharma produktů.

Cíle a přehled studie

Tato studie hodnotí kombinaci Vanquish UHPLC s Acclaim C18 RSLC kolonkou a Q Exactive HF Orbitrap spektrometrem pro peptidový mapping monoklonálních protilátek. Modelovými analyty byly rituximab a denosumab. Byly porovnány chromatografické gradienty různé délky (5, 8, 13, 20, 30 min) s cílem maximalizovat rychlost, citlivost a sekvenční pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly denaturovány v 7 M ureu, redukovány DTT, alkylační IAA a enzymaticky štěpeny trypsinem při 37 °C přes noc. Separace probíhala na Vanquish UHPLC (Acclaim RSLC 120, C18, 2,2 µm, 2,1 x 250 mm) s 0,1 % kyselinou mravenčí v H2O/ACN gradienty. Teplota 60 °C, objem injekce 2 µl, detekce při 214 nm. MS analýza na Q Exactive HF s HESI-II zdrojem v režimu Full MS a datově závislé MS/MS (Top5, HCD).

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny gradienty (5–30 min) přinesly 100 % sekvenční pokrytí obou řetězců mAb, včetně nejkratšího 5 min běhu. Šířka píků v polovině maxima se pohybovala kolem 1,4 s, což umožnilo získat průměrně 6 Full MS a 25 MS/MS skenů na pík. Relativní kvantifikace nejčastějších modifikací (oxidace Met, deamidace Asn, různá glykana) vykazovala minimální odchylky mezi metodami (σ ~ 0,19 %). Simulované a získané MS/MS spektra glycopeptidů prokázala přesnou lokalizaci modifikací i při ultra-rychlých bězích.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí robustní a reprodukovatelné řešení pro rychlou kontrolu kvality mAb během vývoje a výroby bioterapeutik. Vysoká propustnost a zachování detailu PTM umožňují efektivní screening klonů, monitoring glykozylace a dalších kritických atributů v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizace přípravy vzorků a online řízení datových toků
• Další zkracování běhů kombinované s mikroproudovými systémy pro úsporu reagencí
• Rozšíření na jiné bioterapeutiky, včetně konjugovaných protilátek a rekombinantních proteinů
• Využití strojového učení pro pokročilou analýzu spekter a detekci neočekávaných PTM

Závěr

Kombinace Vanquish UHPLC a Q Exactive HF umožňuje ultrarychlý a spolehlivý peptidový mapping mAb s plným sekvenčním pokrytím a konzistentní kvantifikací PTM. Metoda představuje významný krok k vysokopropustným analytickým platformám v biopharma průmyslu.

Reference

1. Zhang Z. Large-scale identification and quantification of covalent modifications in therapeutic proteins. Anal. Chem. 2009;81:8354-8364
2. Shah B, Jiang XG, Chen L, Zhang Z. LC-MS/MS peptide mapping with automated data processing for routine profiling of N-glycans in immunoglobulins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014;25:999-1011