Agilent Triple Quadrupole LC/MS Peptide Quantitation with Skyline

Význam tématu

Quantitativní analýza peptidů pomocí triple kvadrupólového LC/MS je zásadní pro proteomiku a bioanalytiku. Propojení softwaru Skyline s Agilent instrumentací umožňuje systematickou optimalizaci kolizační energie a přesné sledování analytických přechodů.

Cíle a přehled metodiky

Cílem workflow je poskytnout krok-za-krokem postup od definice peptidů až po finální dynamickou MRM metodu:

• Úprava nastavení Skyline (enzym, kolizační energie, filtrace iontů)
• Import peptidových sekvencí a predikce přechodů
• Export metody nebo transition listu pro MassHunter Data Acquisition
• Nahrání a spuštění metody na Agilent triple kvadrupólu
• Import a vyhodnocení výsledků v Skyline
• Export optimalizované scheduled MRM metody

Použitá metodika

Metodika zahrnuje:

• Optimalizaci kolizační energie: testování řady energií podle nastaveného krokování
• Predikci a výběr nejintenzivnějších produktových iontů v Skyline
• Generování a úpravu LC/MS metod v MassHunter Data Acquisition (import/export CSV nebo přímo z Skyline)
• Grafickou analýzu signálů a retence, výběr nejlepších přechodů
• Vytvoření finální dynamické MRM metody pro rutinní analýzy

Použitá instrumentace

Pro workflow jsou použity:

• Agilent 1220/1260/1260 II/1290 Infinity LC či 1200 Series Rapid Resolution LC
• Agilent 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS System
• Agilent MassHunter Data Acquisition verze B.08.00 nebo novější
• Skyline software verze 3.5 či vyšší

Hlavní výsledky a diskuse

Díky kombinaci Skyline a Agilent MassHunter vznikl robustní postup pro optimalizaci kolizační energie a selektivní sledování peptidů:

• Systematické testování až sedmi kroků kolizační energie pro každý přechod
• Automatické generování přechodových seznamů a LC/MS metod
• Grafická podpora výběru nejintenzivnějších signálů

Přínosy a praktické využití metody

Workflow výrazně zkracuje vývoj kvantitativních LC/MS metod a zajišťuje vysokou reprodukovatelnost, vhodné pro:

• Biomarkerové studie a klinické aplikace
• QA/QC kontroly v biotechnologickém průmyslu
• Akademický výzkum proteomiky

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Autonomní optimalizace kolizační energie pomocí strojového učení
• Rozšířený scheduled MRM pro vyšší propustnost
• Integrace s cloudovými řešeními a pokročilé predikce retence
• Predefinované šablony pro automatizovanou analýzu větších souborů vzorků

Závěr

Popisované workflow nabízí efektivní a vysoce reprodukovatelný přístup k vývoji LC/MS metod pro peptidovou kvantifikaci. Díky modularitě Skyline a Agilent systémů lze proces snadno přizpůsobit různým aplikacím a rozšiřovat o další nástroje automatizace.

Reference

• Agilent Triple Quadrupole LC/MS Peptide Quantitation with Skyline Workflow Guide, 2017