Experimental Strategies to Improve Drug-target Identification in Mass Spectrometry-based Thermal Stability Assays

Význam tématu

Masově spektrometrie založené termální stabilitní testy představují klíčovou techniku pro odhalování vazeb mezi proteiny a farmaky. Umožňují sledovat změny teplot tání proteinů po ošetření ligandy, což přispívá k efektivnějšímu vývoji léčiv a detekci nechtěných off‐target interakcí.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyhodnotit kombinaci tří pokročilých přístupů pro zvýšení kvality a kvantifikace MS‐TSA: ΦSDM (fázově řízená spektrom dekonvoluce), FAIMS (separace iontů podle jejich mobility) a isobarický nosičový kanál (iMAATSA). Metoda byla testována na Jurkat buňkách ošetřených DMSO kontrolou a inhibitorem MEK s následným značením TMT10 plex.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly ohřívány na různé teplotní body, digesce peptidů proběhla enzymaticky a značila se TMT tagy. Vybrané vzorky byly doplněny isobarickým nosičovým kanálem z celobuněčného digestu. Analýza probíhala na LC-MS/MS s Easy Spray ES803, gradiente 90 minut, FAIMS s CV -35, -50 a -65 a ΦSDM při rozlišení 15K s maximální injekční dobou 22 ms a 32 ms. Nosičový kanál zvyšoval signál nízko intenzních peptidů bez ovlivnění tvaru teplotních křivek.

Hlavní výsledky a diskuse

Kombinace všech tří technologií přinesla nejvyšší počet unikátních kvalitních křivek tání proteinů. ΦSDM při 15K umožnilo oddělit izotopy TMT bez ztráty rychlosti. Isobarický nosičový kanál neovlivnil hodnotu tání proteinu MEK2, přesto významně zvýšil počet srovnání vysoce kvalitních křivek ve srovnání s konvenční analýzou.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná MS‐TSA workflow nabízí vyšší citlivost a spolehlivost při profilování protein‐ligand interakcí v komplexních vzorcích. Výsledky mají široké uplatnění v preklinickém vývoji léčiv, identifikaci vedlejších efektů a validaci cílových proteinů v akademickém i průmyslovém prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblasti zvýšení multiplexní kapacity, integrace s dalšími separačními metodami a plné automatizace workflow. Kombinace termálních testů s dalšími omickými technologiemi nabídne komplexnější pohled na farmakodynamiku v živých systémech.

Závěr

Studie prokázala, že synergická aplikace ΦSDM, FAIMS a isobarického nosičového kanálu výrazně zlepšuje kvalitu a rozsah MS‐TSA analýz bez negativního dopadu na přesnost stanovení teploty tání.

Reference

1. Seashore Ludlow B Axelsson H Lundbäck T Perspective on CETSA literature Toward more quantitative data interpretation SLAS DISCOVERY 25 118 126 2020
2. Savitski MM et al Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome Science 346 1255784 2014
3. Molina DM et al Monitoring Drug Target Engagement in Cells and Tissues Using the Cellular Thermal Shift Assay Science 341 84 2013
4. Kelstrup C Aizikov K Batth T Kreutzman Grinfeld D Lange Mourad Makarov Olsen Limits for Resolving Isobaric Tandem Mass Tag Reporter Ions Using Phase Constrained Spectrum Deconvolution Journal of Proteome Research 2018
5. Schweppe DK et al Characterization and Optimization of Multiplexed Quantitative Analyses Using High Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Mass Spectrometry Analytical Chemistry 91 4010 4016 2019
6. Yi L et al Boosting to Amplify Signal with Isobaric Labeling BASIL Strategy for Comprehensive Quantitative Phosphoproteomic Characterization Analytical Chemistry 91 5794 5801 2019
7. Grinfeld D Aizikov Kreutzmann Damoc Makarov Phase Constrained Spectrum Deconvolution for Fourier Transform Mass Spectrometry Analytical Chemistry 89 1202 1211 2017