HIGHER SENSITIVITY, DATA QUALITY AND THROUGHPUT FOR HYDROGEN DEUTERIUM EXCHANGE EXPERIMENTS WITH EXTENDED ION MOBILITY SEPARATION

Význam tématu

Studium vyššího řádu struktury proteinů a jejich dynamiky je nezbytné pro pochopení biologické funkce a vývoj terapeutických biomolekul. Metoda výměny vodíku za deuterium (HDX) propojená s hmotnostní spektrometrií (MS) umožňuje mapovat flexibilitu a skládání bílkovin v řešení. Zvýšení citlivosti, kvality dat a propustnosti experimentů HDX-MS je klíčové pro zpracování komplexních vzorků a zrychlení procesů výzkumu i rutinní analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie je porovnat výkonnost nového selektivního cyklického iontového mobility separátoru (SELECT SERIES Cyclic IMS) se stávajícími přístroji SYNAPT G2-Si a SYNAPT XS. Autoři hodnotili počet identifikovaných peptidů, sekvenční pokrytí a kvalitu izotopových distribucí při různých koncentracích vzorku a zkrácených chromatografických gradientech za účelem zvýšení propustnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizace a chromatografie:

• LEAP HDX-2 Automation & ACQUITY M-Class HDX systém s online pepsinovou kolonkou (Enzymate BEH Pepsin, 2.1 × 30 mm, 5 μm).
• Chromatografie na VanGuard BEH C18 trapu (2.1 × 5 mm) a analytickém UPLC BEH C18 (1.0 × 100 mm, 1.7 μm).
• Původní gradient 7 min vs. zkrácený 3 min (celkem 8 min běhu).

Iontová mobilita a MS:

• SELECT SERIES Cyclic IMS se škálovatelným rozlišením a duálním zesilovačem ADC.
• Srovnání s přístroji SYNAPT G2-Si a SYNAPT XS za stejných podmínek HDMSE („data-independent acquisition“).
• Parametry: pozitivní ionizace, m/z 50–2000, kapilární napětí 2.8 kV, přepínané CE 20–29 V, StepWave transfer XS.

Vzorek:

• Glykogen fosforylasa B (Rabbit Phosphorylase B), 1:20 označovací poměr v D₂O pH 6.6, následné ochlazení a zředění do pH 2.4.
• Injektované množství 10–40 pmol peptidů (8, 16, 32 μM roztok).

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání počtu peptidů a sekvenčního pokrytí ukázalo:

• SYNAPT G2-Si: ~240 filtrovaných peptidů, 89 % pokrytí sekvence.
• SYNAPT XS: ~360 peptidů, 98.5 % pokrytí.
• Cyclic IMS: ~560 peptidů, 100 % pokrytí.

Duální zesilovač ADC potlačil saturaci signálu při vysoké intenzitě, což zlepšilo věrnost izotopových distribucí. Při snížených dávkách (10–20 pmol) a zkráceném 3 min gradientu si Cyclic IMS udržel >90 % sekvenčního pokrytí, zatímco u konkurenčních přístrojů došlo k výraznějšímu poklesu počtu identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Využití Cyclic IMS přináší:

• Vyšší citlivost umožňující studium vzorků s omezenou hmotou proteinu.
• Kratší analytické gradienty bez výrazné ztráty datové kvality.
• Rozlišení izotopových vzorců u vysoce nabitých peptidů díky proměnné mobilitě.
• Zvýšení denní propustnosti a snížení nákladů na analýzu HDX-MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v oblasti:

• Integrace vyšších průtoků vzorku a víceúrovňové iontové mobility.
• Automatizace datové analýzy s umělou inteligencí pro rychlejší zpracování komplexních proteinových komplexů.
• Rozšíření aplikací na screening interakcí protein–protein a ligand–protein v preklinickém vývoji.

Závěr

SELECT SERIES Cyclic IMS významně překonává předchozí generace hmotnostních spektrometrů v HDX-MS experimentech. Díky zdokonalenému iontovému mobilitnímu členění, duálnímu ADC zesilovači a optimalizované chromatografii dosahuje vyššího počtu identifikovaných peptidů, lepšího sekvenčního pokrytí i při zkrácených gradientech a nižších dávkách vzorku. To otevírá nové možnosti pro vysoce propustné a citlivé studium struktury proteinů.

Reference

1. Morrison L., Anderson M., Quinn C. Enhanced Performance of the SYNAPT XS and Its Impact on Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX MS) Data Quality. Waters Technical Note #720006870, 2020.
2. Sørensen L., Salbo R. Optimized Workflow for Selecting Peptides for HDX-MS Data Analyses. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2018, 29, 2278–2281. https://doi.org/10.1007/s13361-018-2056-1.