Ion mobility separation of recombinant and synthetic insulin variants on the Cyclic IMS mass spectrometer

Význam tématu

Identifikace a rozlišení syntetických inzulinů od rekombinantního lidského inzulinu je klíčová v oblasti anti-dopingových kontrol, forenzní analýzy a klinických studií. Díky velmi podobným aminokyselinovým sekvencím a identickým molekulovým hmotnostem představují tyto peptidy analytickou výzvu. Cyklická iontová mobilita (cyclic IMS) ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) umožňuje účinné oddělení isobarických analogů bez nutnosti dlouhých chromatografických metod.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na hodnocení výkonnosti cyklické iontové mobility přístroje Waters SELECT SERIES Cyclic IMS QToF při separaci čtyř inzulinových variant (lidský insulin, lispro, aspart, glulisine). Hlavním cílem bylo ověřit schopnost techniky rozlišit izobarické peptidy v čistých vzorcích i ve složité matrici lidské sérum simulující dopingové vzorky.

Použitá metodika

Metodika zahrnovala:

• Statickou infuzi čistých terapeutických inzulinů pomocí zlacených kapilár pro základní hodnocení IM separace.
• Standardní LC-MS analýzu s ACQUITY UPLC CSH C18 kolonkou (130 Å, 2,1×50 mm, 1,7 µm) s gradientem 15–35 % organiky za 9 minut.
• Spiking analogů do extrahovaného séra (5 ng/ml), imunoadsorpční čistění v 2 % octové kyselině a nízkoproudou LC-MS analýzu (IonKey při 2 µl/min, 15min běh).
• Optimalizaci počtu průchodů (5–9) peptidů cyklickou IM cestou při +5 nábojovém stavu a sběr vysokonergních fragmentačních (HDMSe) dat.

Použitá instrumentace

• Waters SELECT SERIES Cyclic IMS QToF (Manchester, UK)
• Waters ACQUITY UPLC I-Class Plus
• ACQUITY UPLC CSH C18 Peptide Column (130 Å, 2,1×50 mm, 1,7 µm)
• Waters ACQUITY UPLC M-Class s IonKey
• UNIFI software pro vizualizaci m/z vs drift time

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly, že:

• Rekombinantní lidský insulin a lispro mají identické m/z, ale odlišné drift time; lispro prolétá IM za kratší dobu.
• Oddělení je možné již bez chromatografie (přímá infuze) při 5–9 průchodech cyklického IM obvodem.
• LC samotné nedokáže rozlišit recHum a lispro, ale následná IM separace je rozlišuje.
• Ve vzorcích ze séra po imunoadsorpci lze díky kombinaci LC, IM a HR-MS oddělit všechny čtyři analogy v jedné analýze.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Významné zkrácení doby analýzy díky eliminaci dlouhých gradientů a MS/MS kroků pro izobarické peptidy.
• Vyšší jistotu identifikace díky simultánnímu získání retention time, drift time, m/z prekurzoru i fragmentů.
• Možnost aplikace v anti-dopingových laboratořích, forenzních centrech a QA/QC řízeních klinických studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Stanovení limitu detekce pro lispro ≤ 0,5 ng/ml a jeho validace v reálných vzorcích.
• Aplikace cyklické IM-MS na další peptidové dopingové látky a biofarmaka.
• Integrace s pokročilými vzorkovacími a čistícími postupy (automatizace, multi-dimenzionální LC).
• Využití zvyšujícího se rozlišení IM pro komplexní mixture biomolekul a proteomiku.

Závěr

Studie prokázala, že cyklická iontová mobilita spojená s high-resolution MS představuje efektivní a spolehlivou techniku pro rozlišení isobarických inzulinových analogů. Metoda zkracuje dobu analýzy, zvyšuje selektivitu a citlivost, což je zásadní pro anti-dopingové kontroly a forenzní identifikaci syntetických inzulinů.

Reference

1. Thomas A, Schänzer W, Thevis M. Determination of human insulin and its analogues in human blood using liquid chromatography coupled to IM mass spectrometry (LC-IM-MS). Drug Test Anal. 2014 Nov-Dec;6(11-12):1125-32. doi:10.1002/dta.1710.