Lipidomics Analysis of Human Plasma Using Agilent Bond Elut Lipid Extraction 96-Well Plates

Význam tématu

Lipidomika umožňuje širokospektrální analýzu lipiduálních molekul v biologických vzorcích a je zásadní pro porozumění metabolickým a signalizačním procesům v organismu. V klinickém i průmyslovém výzkumu je nezbytné zajistit rychlou, spolehlivou a vysoce výkonnou přípravu vzorků lidské plazmy, která umožní zpracování velkých souborů vzorků.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vysoce výkonnou metodu pevně-fázové extrakce (SPE) založenou na Agilent Bond Elut Lipid Extraction 96-well deskách. Hlavním cílem bylo porovnat výkon nové 96-well formy s tradičním řešením na 1 mL kartridžích z hlediska čistoty podkladu, výtěžnosti stabilně značených interních standardů a rozsahu identifikovaných lipidů pomocí LC/Q-TOF a LC/TQ.

Použitá metodika a instrumentace

Extraktivní procedura zahrnovala:

• Proteinovou precipitaci plazmy pomocí 95/5 ACN/MeOH
• Nanesení homogenátu na Bond Elut Lipid Extraction 96-well desku pro gravitační eluci
• Promytí 9:1 ACN:voda a eluční krok 1:2 DCM:MeOH
• Sušení eluátu dusíkem při 30 °C a rekonstituci v n-BuOH:MeOH (1:1)

Klíčové přístroje:

• Agilent 6545 LC/Q-TOF s Jet Stream ESI pro netargetované profilování lipidů
• Agilent 6490 LC/TQ s Jet Stream ESI pro kvantitativní stanovení interních standardů
• Agilent 1290 Infinity II LC a Poroshell 120 EC-C18 kolona (2,1×100 mm, 1,9 µm)
• Bond Elut Lipid Extraction 96-well desky, square-well kolekční desky a automatizační hardware (PPM-96, ViaFlo 96)

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy TIC z LC/Q-TOF ukázaly obdobné eluační profily pro pozitivní i negativní režim, přičemž 96-well metoda vykázala mírně vyšší signál (<20 %) u triacylglycerolů i fosfolipidů. Kvantifikace 63 deuterovaných interních standardů ukázala >70 % průměrnou výtěžnost pro obě SPE formy s rozdílem <5 % u většiny lipidových tříd. Profilování odhalilo přibližně 380 jedinečných lipidů s rovnoměrným zastoupením všech hlavních tříd. Čistota pozadí byla ověřena reakcí prázdné vzorkové dráhy, kde byl minimální šum díky rychlému kontaktu eluátu s plastovým povrchem a použití sklem potažených sběrných desek.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazná úspora času a práce oproti LLE metodám
• Vyšší throughput díky paralelnímu zpracování 96 vzorků
• Zajištěná reprodukovatelnost a kompatibilita s automatizovanými platformami
• Vysoká selektivita a účinné odstranění matricových interferencí

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj integrace s robotizovanými systémy pro bezobslužné zpracování, rozšíření na další biologické matrice (tkáně, buňky) a využití pokročilé datové analýzy pro hlubší interpretaci lipidomických profilů. Potenciál představuje i kombinace s ortogonálními technikami (ion mobility, zachycování reaktantů) pro lepší diferenciaci isobarických lipidů.

Závěr

Použití SPE pomocí Agilent Bond Elut Lipid Extraction 96-well desek bylo prokázáno jako robustní a efektivní alternativa k běžným SPE kartridžím i LLE metodám. Nová forma uspořádání umožňuje zvýšenou produktivitu, minimalizuje laboratorní pracnost a poskytuje stejně kvalitní lipidový profil pro širokou škálu výzkumných i klinických aplikací.

Reference

1. Bligh E.G., Dyer W.J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911–917.
2. Folch J., Lees M., Stanley G.S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J. Biol. Chem. 1957, 226, 497–509.
3. Matyash V. et al. Lipid Extraction by Methyl-tert-Butyl Ether for High-Throughput Lipidomics. J. Lipid Res. 2008, 49, 1137–1146.
4. Löfgren L. et al. The BUME Method: A Novel Automated Chloroform-Free 96-Well Total Lipid Extraction Method for Blood Plasma. J. Lipid Res. 2012, 53, 1690–1700.
5. Apffel A., Zhao L., Sartain M.J. A Novel Solid Phase Extraction Sample Preparation Method for Lipidomic Analysis of Human Plasma Using LC/MS. Metabolites 2021, 11, 294–313.
6. Apffel A., Zhao L. Lipidomic Analysis of Human Plasma Using Bond Elut Lipid Extraction with the Agilent 6545 LC/Q-TOF. Agilent Technologies Application Note 2020, 5994-1783EN.