STANOVENIE IMUNOSUPRESÍVNYCH LIEČIV POMOCOU LC/MS-MS

Význam tématu

Imunosupresivní léky jako cyklosporin A, takrolimus, sirolimus a everolimus mají velmi úzký terapeutický index. Jejich přesné stanovení v krvi je nezbytné k optimalizaci dávkování, prevenci toxických účinků a zajištění funkce transplantovaných orgánů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou, citlivou a selektivní metodu založenou na kapalinové chromatografii v tandemu s hmotnostní spektrometrií (LC–MS/MS) pro kvantifikaci čtyř klíčových imunosupresiv v plné krvi pacientů po transplantaci.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla uplatněna proteinová srážka pomocí směsi ZnSO₄/methanol. Chromatografická separace probíhala na UPLC kolóně Acquity HSS C18 (50×2,1 mm, 1,8 µm) při teplotě 60 °C s gradientem vodné fáze (10 mmol/l octanu amonného, pH 4,0) a acetonitrilu. Detekce byla prováděna na trojitopólovém kvadrupólu Agilent 6460 v pozitivním ESI módu v režimu MRM s použitím izotopicky značených interních standardů.

Použitá instrumentace

• UPLC systém Agilent 1260 (binární pumpy, termostat, odplyňovač, kolónový inkubátor)
• Analytická kolona Acquity HSS C18 a predkolona HSS C18
• MS detektor Agilent 6460 TripleQuad s ESI zdrojem
• Software MassHunter Optimizer pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou linearitu (r² > 0,99) v rozmezí:

• 100–1000 ng/ml pro cyklosporin A
• 10–50 ng/ml pro takrolimus a sirolimus
• 6–40 ng/ml pro everolimus

Mez stanovení činily 1,3 ng/ml (CycA), 1,4 ng/ml (SIR), 1,3 ng/ml (TACR) a 2,2 ng/ml (EVER). Precisnost i správnost byly v mezích 3–11 % (RE) a 2–13 % (CV). Výtěžnost extrakce se pohybovala mezi 81–92 %. Analýza 1600 klinických vzorků potvrdila dobrou opakovatelnost, absenci interferencí a stabilitu kolony bez změny selektivity.

Přínosy a praktické využití metody

Tato LC–MS/MS metoda umožňuje simultánní stanovení všech čtyř imunosupresiv s krátkým časem analýzy (5 min), s minimálními náklady na přípravu vzorku a vysokou odolností vůči matricovým efektům. Je vhodná pro rutinní terapeutické monitorování (TDM) v laboratořích transplantačních center.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace mikrofluidních systémů pro rychlejší přípravu vzorku, využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie pro širší panel léčiv a metabolit, automatizace procesů a integrace výsledků do elektronických zdravotních záznamů pro on-line úpravu dávek imunosupresiv.

Závěr

Validovaná LC–MS/MS metoda splňuje přísné požadavky na citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost. Je ekonomicky výhodná a plně vyhovuje potřebám klinické praxe při monitorování imunosupresiv u transplantovaných pacientů.

Reference

1. Freudenberger K. et al.: Trends Anal. Chem. 79, 257 (2015)
2. Taylor P. J. et al.: Clin. Biochem. 44, 14 (2011)
3. Meinitzer A. et al.: Ther. Drug Monit. 32, 61 (2010)
4. Matuszewski B. K. et al.: Anal. Chem. 75, 3019 (2003)
5. FDA Guidance for industry: Bioanalytical method validation (2001)