Characterization of Biotherapeutics: ACQUITY UPLC H-Class Bio with 2D Part 1 of 3: On-line Desalting of Biotherapeutic Samples for Increased Productivity

Význam tématu

Charakterizace nabíjecích variant terapeutických proteinů je zásadní pro zajištění kvality a účinnosti bioléčiv. Ionexchanzové metody nabízejí detailní pohled na složení variant, avšak použití solí a pufrů komplikuje přímé navázání na hmotnostní spektrometrii, což prodlužuje analýzu a snižuje produktivitu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem první části série je prokázat možnosti automatizovaného on-line odsolení vzorků bioléčiv pomocí ACQUITY UPLC H-Class Bio s 2D technologií a heart-cut přístupem. Studie ukazuje, jak lze kombinovat iontovou výměnu (IEX) a reverzní fázi (RPLC) v dvoudimenzionální separaci, aby vznikl vzorek kompatibilní s hmotnostní spektrometrií a dalšími analýzami.

Použitá metodika a instrumentace

• Přístroj: ACQUITY UPLC H-Class Bio System s 2D Technology
• Pumpy: Quaternary Solvent Manager pro IEX, Binary Solvent Manager pro RPLC
• Detektory: TUV na první dimenzi, PDA na druhé dimenzi
• Kolony: Protein-Pak Hi Res SP SCX 7 µm, 4,6×100 mm; BEH C4 1,7 µm, 2,1×50 mm
• Podmínky: gradient 25–65 mM NaCl v 20 mM MES pH 6,8 (IEX); gradient 0–95 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny octové (RPLC)
• Teplota: 25 °C (IEX), 80 °C (RPLC); objem injekce 2 µL; vzorek infliximab 20 mg/mL

Hlavní výsledky a diskuse

Heart-cut proces umožnil selektivní přesměrování střední části chromatografického píku (+0 lysin varianta) z IEX kolony na RPLC kolonu. Frakce byla zachycena na hlavici druhé dimenze, kde během 5 minut došlo k efektivnímu odstranění solí pomocí vodné fáze. Následné eluce v organické fázi poskytla analyticky čistý protein připravený pro mass spectrometry. Celý proces probíhá automatizovaně, zkracuje dobu přípravy a minimalizuje manuální zásahy, aniž by utrpělo rozlišení separace.

Přínosy a praktické využití metody

• Plná automatizace frakcionace a odsolení zvyšuje pracovní průchodnost
• Eliminace offline kroků snižuje riziko kontaminace a chybných zásahů
• Přímá kompatibilita s hmotnostní spektrometrií a enzymatickými digescemi
• Flexibilní konfigurace dvoudimenzionální separace pro různá bioléčiva

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití 2D UPLC heart-cut technik pro integraci s pokročilými MS a automatizovanými enzymatickými procesy. Další kapitoly mohou zahrnovat on-line obohacení nízkokoncentrovaných složek, analýzu glykovaných proteinů a využití umělé inteligence k optimalizaci parametrů separace.

Závěr

ACQUITY UPLC H-Class Bio System s 2D technologií a heart-cut procesem představuje efektivní, flexibilní a plně automatizovaný postup pro frakcionaci a odsolení bioléčiv. Tento přístup významně zkracuje dobu přípravy vzorků, zvyšuje produktivitu a zajišťuje vysokou kvalitu dat pro následné analýzy.

Reference

1. Liu et al Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies mAbs 2012 4(5) 578–585
2. Rea et al Validation of a pH gradient-based ion-exchange chromatography method for high-resolution monoclonal antibody charge variant-separations Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011 54 317–323
3. Annesley T Ion Suppression in Mass Spectrometry Clinical Chemistry 2003 49(7) 1041–1044