TEORETICKÉ ZÁKLADY A SEPARAČNÍ PRINCIPY KAPILÁRNÍCH ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD

Význam tématu

Kapilární elektromigrační metody (HPCE) představují vysoce citlivé a rychlé techniky pro separaci iontů, makromolekul i komplexů biologicky aktivních látek. Díky minimálnímu objemu vzorku (nano- až pikolitrové řády) a schopnosti dosáhnout femtomol–zeptomolové detekce se staly významným doplňkem vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a klasické gelové elektroforézy (PAGE). Jejich šíře aplikací zahrnuje analýzu peptideů, bílkovin, nukleových kyselin i farmaceutických látek v QA/QC laboratořích i výzkumných odděleních.

Cíle a přehled studie / článku

Primárním cílem článku je stručně shrnout teoretické základy a rozdělení hlavních kapilárních elektromigračních technik, mezi něž patří:

• zónová elektroforéza (CZE)
• izotachoforéza (ITP)
• izoelektrická fokusace (IEF)
• elektroforéza v sítovacích médiích (CGE, PFCE)
• bioafinitní elektroforéza (BACE)
• elektrokinetická chromatografie (EKC)
• elektrochromatografie (CEC)

Článek také naznačuje hlavní směřování vývoje v oblasti modelování a počítačové simulace HPCE.

Použitá metodika a instrumentace

Popis základního experimentálního uspořádání HPCE je společný pro většinu technik:

• tenká křemenná kapilára (vnitřní průměr 50–75 μm, délka 30–80 cm)
• elektrodové nádobky s platinovými elektrodami
• zdroj vysokého napětí (do ~30 kV, režimy konstantního napětí, konstantního proudu či výkonu)
• UV–VIS absorpční detektor "on-column" pro kontinuální sledování migračních zón
• řídicí a sběrné PC s funkcí pro počítačovou simulaci pohybu zón

Hlavní výsledky a diskuse

1. Teoretické základy vysvětlují rovnici elektroforetické pohyblivosti a elektroosmotického toku v závislosti na náboji iontu, velikosti, viskozitě prostředí a povrchových vlastnostech kapiláry.
2. Diskontinuální ITP vytváří ostré zóny díky samozaostřujícímu efektu Kohlrauscheovy regulační funkce.
3. IEF v kapilárách vyžaduje potlačení elektroosmotického toku a mobilizaci fokusovaných zón pro detekci.
4. Sítové média (kovalentní gely i fyzikální sítě z lineárních polymerů) umožňují separaci makromolekul podle velikosti. PFCE využívá pulzní pole pro dělení velmi velkých DNA fragmentů.
5. Bioafinitní elektroforéza kombinuje imobilizované ligandy (např. konkanavalin A) s elektroforetickou separací pro selektivní detekci biomolekul.
6. EKC a CEC kombinují elektroosmózu a chromatografické principy, kde pseudostacionární fáze (micely, cyklodextriny, ionogenní polymery, mikroemulze) poskytují další rozměr selektivity.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a vysoce účinné separace s možností simultánního měření aniontů i kationtů.
• Minimální spotřeba vzorku a látek, nízké náklady na chemikálie.
• Široké spektrum aplikací: farmacie, biochemie, forenzní analýzy, environmentální monitorování.
• On-line spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) a NMR pro strukturní analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace – vývoj kapilárních mikročipů (lab-on-a-chip).
• Vylepšená povrchová úprava kapilár pro řízenou elektroosmózu a snížení adsorpce biomolekul.
• Nové pseudofáze a deriváty cyklodextrinů pro vyšší selektivitu EKC.
• On-line hyphenace s hmotnostní spektrometrií a NMR, automatizace provozu.

Závěr

Kapilární elektromigrační metody představují klíčové nástroje pro moderní analytickou chemii. Kombinací různých separačních principů dosahují vysoké účinnosti, citlivosti a rozšířeného aplikačního spektra. Budoucnost patří miniaturizaci, novým materiálům a integraci s detekčními technikami vyšší úrovně.

Reference

1. Li S. F. Y.: Capillary Electrophoresis – Principles, Practice, Applications. Elsevier, Amsterdam 1992.
2. Grossman P. D., Colburn J. C. (eds.): Capillary Electrophoresis, Theory and Practice. Academic Press, San Diego 1992.
3. Wiktorowicz J. E. (ed.): Capillary Electrophoresis. Academic Press, New York 1992.
4. Foret F., Křivánková L., Boček P.: Capillary Zone Electrophoresis. VCH, Weinheim 1993.
5. Weinberger R.: Practical Capillary Electrophoresis. Academic Press, Boston 1993.
6. Kuhn R., Hofstetter-Kuhn S.: Capillary Electrophoresis. Springer-Verlag, New York 1993.
7. Guzman N. A. (ed.): Capillary Electrophoresis Technology. Marcel Dekker, New York 1993.
8. Jandíček P., Bonn G.: Capillary Electrophoresis of Small Molecules and Ions. VCH, Cambridge 1993.
9. Camilleri P. (ed.): Capillary Electrophoresis – Theory and Practice. CRC Press, Boca Raton 1994.
10. Hartwick R. A.: Introduction to Capillary Electrophoresis. CRC Press, Boca Raton 1994.
11. Landers J. P. (ed.): Handbook of Capillary Electrophoresis. CRC Press, Boca Raton 1994.
12. Coleman D. (ed.): Directory of Capillary Electrophoresis. Elsevier, Amsterdam 1994.
13. Baker D. R.: Capillary Electrophoresis. Wiley, New York 1995.
14. Altria K. D.: Capillary Electrophoresis Guidebook. Humana Press, Totowa 1995.
15. Righetti P. G. (ed.): Capillary Electrophoresis in Analytical Biotechnology. CRC Press, Boca Raton 1995.
16. Boček P., v knize: Nové trendy v teorii a instrumentaci vybraných analytických metod. Academia, Praha 1993.
17. Kasička V., Prusík Z., v knize: Encyclopedia of Analytical Science. Academic Press, London 1995.