Multicomponent Analysis of Metabolites in Human Plasma using GC-MS/MS

Význam tématu

Analýza metabolomů v biologických vzorcích hraje klíčovou roli při hledání biomarkerů nemocí, monitorování farmakologických účinků a pro klinické studie. Tradiční single quadrupole GC-MS nabízí vynikající chromatografické rozlišení, avšak v komplexních matricích, jako je lidská plazma, může docházet k potlačení signálu a křížovým interferencím. Použití triple quadrupole GC-MS/MS v režimu MRM (Multiple Reaction Monitoring) zajišťuje dvojitou selekci štěrbinami Q1 a Q3, což výrazně zlepšuje citlivost a selektivitu kvantifikace metabolitů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo porovnat výsledky analýzy standardní lidské plazmy získané metodami scan a MRM podle protokolů obsažených ve Smart Metabolites Database. Databáze zahrnuje MRM přechody pro 475 běžných metabolitů v krevní plazmě, moči a buněčných extraktech. Studie se zaměřila na hodnocení počtu detekovaných derivatizovaných metabolitů, citlivosti měření a potlačení interferenčních signálů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plazmy (50 µL) byl doplněn interním standardem (2-isopropylmalát), extrahován methanol/voda/chloroformem (2,5:1:1) a derivatizován methoximací a trimethylsilylací. Měření probíhalo na GC-MS/MS systému GCMS-TQ8040 se sloupcem BPX-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm). Klíčové parametry:

• Teplota injektoru: 250 °C, split 30:1, objem 1 µL
• Program kolony: 60 °C (2 min) → 15 °C/min → 330 °C (3 min)
• Interface: 280 °C, ion source: 200 °C, nosič plyn: helium, lineární rychlost 39 cm/s
• Měření: scan režim (m/z 45–600, event time 0,2 s) a MRM režim (loop time 0,25 s)

Hlavní výsledky a diskuse

MRM přineslo výrazné zvýšení citlivosti a potlačení interferencí ve srovnání se scan módem. Celkový iontový chromatogram (TIC) ukázal ostré, dobře oddělené píky. Ve scan režimu nebylo detekováno několik metabolitů kvůli křížovým signálům; v MRM režimu bylo možné kvantifikovat i nízkokoncentrované složky.
Bylo identifikováno a kvantifikováno celkem 221 TMS-derivatizovaných metabolitů z 475 možných. Příklady: ve scan režimu se potlačil signál kyseliny valproové a 3-aminoisobutyrátu, MRM režim však přinesl čisté chromatografické píky a vyšší intenzity.

Přínosy a praktické využití metody

MRM na triple quad GC-MS/MS umožňuje cílenou, vysoce citlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci stovek metabolitů ve složitých biologických matricích. Metoda je vhodná pro klinické laboratoře, farmakokinetická měření, toxikologii, nutriční studie i průmyslovou kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření databází MRM přechodů, vývoj rychlejších chromatografických protokolů a automatizace vzorkové přípravy. Integrace s vysokým rozlišením (HR-MS) a pokročilá datová analýza (strojové učení, chemometrie) posunou metabolomiku k ještě hlubší a širší charakterizaci biologických systémů.

Závěr

Studie potvrdila, že triple quadrupole GC-MS/MS v MRM režimu nabízí výrazně lepší citlivost, selektivitu a robustnost pro analýzu komplexních metabolomů v lidské plazmě. Umožňuje detekci více než 200 derivatizovaných metabolitů a usnadňuje spolehlivou kvantifikaci v klinických i výzkumných aplikacích.

Reference

1. Nishiumi S., Shinohara M., Ikeda A. et al. Metabolomics 6 (2010) 518–528