Improving HPLC Column Selection and System Performance

Význam tématu

HPLC je základní nástroj analytické chemie, který umožňuje separaci, identifikaci i kvantifikaci široké škály látek. Správná volba kolony a optimalizace HPLC systému významně ovlivňuje rychlost analýzy, rozlišení a citlivost měření. Dnešní trendy v particle technologii i konstrukci přístrojů umožňují dosáhnout vynikající účinnosti i v aplikacích s malými rozměry kapilár a rychlými separacemi.

Cíle a přehled studie

Studie Richarda A. Henryho se zaměřuje na dvě hlavní oblasti:

• Inovace v oblasti částic kolony (velikost, tvar, struktura) a jejich vliv na chromatografickou účinnost.
• Analýzu a minimalizaci extra-column (mimo kolonový) disperze včetně dopadu injektoru, spojovacích hadiček, detektoru a dalšího vybavení.

Použitá metodika a instrumentace

Pro posouzení systémové disperze a celkové účinnosti byly použity:

• Kolony Ascentis C18 (5 μm), Ascentis Express C18 (2,7 μm fused-core), Zr-PBD sub-2 μm.
• HPLC systémy Agilent 1100, Agilent 1200, Waters 2695, Waters Acquity a Shimadzu LC-10A.
• Použité průtokové cely o objemu 16 μL (10 mm), 5 μL (5 mm) a menší mikroflow cely.
• Spojovací tubingy s vnitřním průměrem 0,010” a 0,005”, injektory se zpětnými ventily (ZDV union).
• Detekce UV při 254 nm, teploty kolony až 75 °C, průtoky 0,3–2,5 mL/min.
• Metody vyhodnocení:
  
  1. System suitability test: měření počtu destilačních třetin (N) kolony i celého systému při různých k hodnotách.
  2. Direct IBW test: připojení injektoru ke detektoru bez kolony a výpočet instrumentální šířky pásma (4σ).
  3. Analýza van Deemterovy rovnice pro součtové příspěvky multipath (A), difuze (B) a přenos hmoty (C).

Hlavní výsledky a diskuse

• Vývoj částic kolony od nepravidelných přes kulaté až po monolitické (1970–2000) podstatně snížil vnitrokolónovou disperzi, umožnil užití menších průměrů a vyšších průtoků.
• Solid-core („fused-core“) částice přinesly vysokou účinnost, ostřejší píky a nižší tlakové poklesy než plně porézní částice.
• Extra-column disperze (IBW) se ukazuje jako klíčová pro krátké kolony a malý k, přičemž příspěvky hadiček, injektoru a detektoru mohou tvořit až 90 % celkové variance.
• Optimalizace Agilent 1100 (mikro cely, 0,005” tubing) snížila IBW z ~50 µL na ~12 µL, což přineslo výrazné zlepšení účinnosti i rozlišení.
• Data sampling rate (min. 20–40 vzorků na šířku píku) a rychlá odezva detektoru (<0,1 s) jsou nezbytné pro přesné měření šířky píku a skutečné instrumentální šířky pásma.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace extra-column disperze a volba vhodné kolony umožňuje:

• Rychlejší analýzy s vyšším rozlišením i citlivostí.
• Efektivní nasazení moderních sub-2 µm a fused-core kolon na standardních HPLC přístrojích.
• Spolehlivou kvalifikaci přístrojů systémovými testy, které odhalí slabá místa v konfiguraci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace tubingu a průtokových cest směrem k mikro- a nanolitrovým objemům.
• Integrace termostatovaných low-dispersion spojů a injektorů pro vysokoteplotní aplikace.
• Vyšší tlakové limity přístrojů (>1000 bar) pro plné využití sub-2 µm technologií.
• Pokročilé algoritmy pro automatickou optimalizaci systému a korekci šířky pásma v reálném čase.

Závěr

Souhrnně lze konstatovat, že moderní částicové technologie a pečlivá optimalizace přístrojové konfigurace vedou k výraznému zlepšení chromatografické účinnosti. Minimalizace mimo-kolónové disperze je klíčová pro plný výkon sub-2 µm a fused-core kolon i na konvenčních HPLC systémech.

Reference

• Chester T.L., American Lab, Vol. 41 No. 4, 2009.
• Fekete S. et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 49, 64–71 (2009).
• Gritti F., Guiochon G., J. Chromatogr. A, 1217, 3000–3012 (2010).
• Henry R.A., Bell D.S., LCGC NA, Vol. 23 No. 5, 2005.
• Majors R., LCGC NA, Vol. 21 No. 12, 2003.
• Brandes H., Sigma-Supelco internal reports (2008–2009).
• Henry R.A., Nowlan D., EAS 2009.