Instructions & Troubleshooting for HybridSPE®-Phospholipid Ultra Cartridge

Význam tématu

Analýza malých molekul v biologických matricích pomocí LC-MS/MS často trpí potlačením signálu vlivem zbytkových fosfolipidů a proteinů. HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge nabízí spolehlivou a rychlou očistu plazmy či séra díky kombinaci precipitace proteinu a selektivní adsorpce fosfolipidů na sorbent s funkčními ionty zirkonia. Tato metoda zvyšuje citlivost a přesnost měření v biomedicínském výzkumu, farmakokinetice a kontrolách kvality léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem dokumentu je popsat produkt HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge, ukázat univerzální protokol přípravy vzorku in-tube precipitací, uvést klíčové vlastnosti kartridže a řešit nejčastější otázky při aplikaci metody. Prezentována je také sekundární strategie pro sloučeniny vykazující nízké výtěžky pomocí odlišných precipitujících činidel.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku se využívá kombinace proteinové precipitace a SPE:

1. Na 100 µl plazmy se přidá interní standard (dle potřeby).
2. Přidá se 300 µl acetonitrilu s 1 % kyselinou mravenčí (poměr 1:3), protřepání 1 minutu při 4000 cyklech/min.
3. Vzorek je propuštěn vakuu –15 in Hg nebo pozitivním tlakem skrze HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge.

HybridSPE sorbent využívá Lewisovy kyseliny na bázi zirkoniových iontů k selektivnímu zachycení fosfolipidů, zatímco precipitovaný protein je zachycen mechanicky. Doporučený objem plazmy se pohybuje mezi 30 a 100 µl, maximálně však 100 µl pro optimální výkon. V případě nízké nebo vysoké observace signálu se navrhuje odpaření eluátu a rekonstituce v menším objemu mobilní fáze LC-MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Tabulkově uváděná retenční kapacita kartridže pro plazmu max. 100 µl a mrtvý objem cca 90 µl odpovídají očekávaným hodnotám. Uživatelé mohou zaznamenat:

• Potlačení iontového signálu i po SPE, pokud zůstávají jiné matrixové interferenty (např. citrát, plastifikátory, PEG).
• Změny objemu eluátu vlivem odpařování při vakuové extrakci až 10–20 µl na vzorek 400 µl.
• Vysoké (>100 %) nebo nízké (<50 %) absolutní výtěžky v důsledku buď odpaření proměnných objemů nebo sekundárních interakcí (HILIC, iontová výměna).

Pro bázi obsahující aminoskupinu se doporučuje 1 % mravenčitan amonný v methanolu, čímž se zamezí sekundární iontové výměně a HILIC interakcím. Pro chelatační kyseliny je vhodné použití 0,5 % kyseliny citrónové v acetonitrilu, která silně inhibuje vazbu chelátorů a zároveň nebrání retenci fosfolipidů.

Přínosy a praktické využití metody

HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge přináší efektivní odstranění proteinů a fosfolipidů, čímž:

• Minimalizuje iontovou supresi v LC-MS/MS analýzách.
• Zvyšuje reprodukovatelnost a robustnost analýzy biologických vzorků.
• Zkracuje dobu přípravy vzorku a snižuje potřebu složitých kroků extrakce.

Metoda je vhodná pro farmakokinetické studie, toxikologii, vývoj léčiv, environmentální monitorování i rutinní QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj sorbentů s vyšší selektivitou vůči širšímu spektru interferentů, integrace přípravy vzorků do automatizovaných mikrofluidních platforem a kombinace s vysokorozlišeným MS. Dále je perspektivní adaptace postupu na nestandardní matrice (tkáňové extrakty, močí) a miniaturizace objemů pro sporé vzorky.

Závěr

HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge představuje univerzální a uživatelsky přívětivou platformu pro odstranění proteinů a fosfolipidů z biologických vzorků před LC-MS/MS analýzou. Díky jednoduchému protokolu in-tube precipitace a selektivnímu sorbentu je dosaženo významného snížení iontové suprese, vyšší citlivosti a reprodukovatelnosti výsledků.

Reference

• Sigma-Aldrich Co., 2010. Data Sheet: Instructions & Troubleshooting for HybridSPE-Phospholipid Ultra Cartridge.