Mapping IgG Subunit Glycoforms Using HILIC and a Wide-Pore Amide Stationary Phase

Význam tématu

Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) s amide stacionární fází umožňuje detailní analýzu glykosylace imunoglobulinů zásadní pro kvalitu a účinnost monoklonálních protilátek. Komplementární k tradičním reverzním fázím nabízí odlišnou selektivitu pro polysacharidové modifikace.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje metodiku pro separaci a mapování glykokonformací subjednotek IgG (Fc/2, LC, Fd′) pomocí HILIC na širokopórové BEH amide 300 Å 1,7 µm kolonce. Cílem je dosáhnout vysoké rozlišovací schopnosti, opakovatelnosti a kompatibility s MS a UV detekcí.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300 Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• Xevo G2 QTof a SYNAPT G2-S HDMS
• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 130 Å, 1.7 µm, 2.1×50 mm

Metodika

IgG protilátky (trastuzumab, cetuximab, NIST IgG1K) byly podrobeny IdeS proteolýze a redukci TCEP a GuHCl. Následovalo kondicionování kolonek a HILIC gradientní separace s mobilními fázemi 0,1 % TFA ve vodě a acetonitrilu. Detekce probíhala UV při 214 nm a ESI-MS; u uvolněných N-glykanů fluorescence Ex/Em 265/425 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

• HILIC rozlišuje Fc/2 glykokonformace do desítek špiček s rozlišením Rs≈2, umožňuje přesné dekonvoluce hmotnostních spekter.
• Opakovatelnost: po 300 injekcích zachovány jednotné retenční časy, rozlišení i nízké rozstřiky (<0,2 %) a stálý tlak ~6 000 psi.
• Benchmark: BEH amide 300 Å předstihla BEH amide 130 Å o 48 % a konkurenci až o 261 % z hlediska poměru špička-údolí pro FA2 vs FA2G1.
• Cetuximab: dvoudoménová glykosylace (CH1, CH2) odhalena HILIC-UV-MS; identifikovány imunogenní glykoformy na subjednotce Fd′.
• Komplement k RapiFluor-MS: uvolněné N-glykany potvrdily strukturální identifikace glykakonformací detekovaných na subjednotkách.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje rychlé a informačně bohaté šaržové testy glykosylace pro QC a vývoj biosimilárních mAb. Umožňuje doménově specifickou charakterizaci bez náročného uvolňování glykosidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HILIC-MS do rutinní QC a certifikace referenčních materiálů mAb.
• Vývoj cílených SRM/MRM metod pro sledování nízkoabundantních glykoform.
• Další zlepšení stacionárních fází pro větší rozlišovací schopnost a stabilitu.
• Kombinace s automatizovanou přípravou vzorků a digitálními platformami pro AI-podporu analýz.

Závěr

Širokopórová BEH amide 300 Å kolona představuje robustní a vysoce selektivní nástroj pro subjednotkové mapování glykokonformací IgG. Ve spojení s MS a RapiFluor-MS značením umožňuje komplexní charakterizaci doménové glykosylace pro biotechnologický výzkum a kontrolu kvality.

Reference

1. Aggarwal R S What’s fueling the biotech engine 2012 to 2013 Nat Biotechnol 2014 32 32–9
2. Wang B et al Structural comparison of two anti-CD20 mAb drug products using middle-down MS Analyst 2013 138 3058–65
3. Gucinski A C Rapid Characterization and Comparison of Stressed anti-CD20 Drugs using Middle Down MS ASMS 2013
4. Ayoub D et al Correct primary structure assessment and glycoprofiling of cetuximab by ESI and MALDI MS MAbs 2013 5 699–710
5. Beck A et al Analytical characterization of biosimilar antibodies Trends Anal Chem 2013 48 81–95
6. Janin-Bussat M C et al Cetuximab Fab and Fc N-glycan fast characterization using IdeS and LC-ESI-MS Methods Mol Biol 2013 988 93–113
7. Ahn J et al Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using HILIC columns J Chromatogr B 2010 878 403–8
8. Gustavsson P-E Larsson P-O Support Materials for Affinity Chromatography Handbook of Affinity Chromatography 2006
9. Renkin E M J Gen Physiol 1954 38 225
10. Tetaz T et al HILIC of intact proteins J Chromatogr A 2011 1218 5892–6
11. Beck A Sanglier-Cianferani S Van Dorsselaer A Biosimilar and next generation antibody characterization by MS Anal Chem 2012 84 4637–46
12. Lauber M A et al Developing High Resolution HILIC Separations of Intact Glycosylated Proteins Waters App Note 720005380EN
13. Xie H et al Rapid comparison of a candidate biosimilar to an innovator mAb MAbs 2010 2 4
14. Yu Y Q et al Trastuzumab Glycan Batch-to-Batch Profiling using UPLC/FLR/MS Waters App Note 720003576EN
15. Raju T S Jordan R E Galactosylation variations in marketed therapeutic antibodies MAbs 2012 4 385–91
16. Schiel J et al Evaluation of the NIST Monoclonal Antibody Reference Material ASMS 2014
17. Bosques C J et al CHO cells can produce alpha-gal antigens Nat Biotechnol 2010 28 1153–6
18. Jefferis R Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics Biotechnol Prog 2005 21 11–16
19. Huang L et al Impact of variable domain glycosylation on clearance Anal Biochem 2006 349 197–207
20. Qian J et al Structural characterization of cetuximab N-glycans by MALDI-QqTOF MS Anal Biochem 2007 364 8–18
21. Arnold D F Misbah S A Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for alpha-gal N Engl J Med 2008 358 2735
22. Lauber M A et al Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Label Waters App Note 720005275EN