Automated Solid-Phase Extraction for the Analysis of Metanephrine and Normetanephrine from Plasma using ACQUITY UPLC-MS/MS for Clinical Research

Význam tématu

Analýza metanephrinu a normetanephrinu v plazmě je klíčová pro diagnostiku a výzkum stavů spojených s nadměrnou produkcí katecholaminů. Tradiční HPLC-ECD a imunoanalytické metody bývají časově náročné, pracovně intenzivní a často vykazují omezenou analytickou specifitu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit plně automatizovaný offline SPE protokol pro izolaci metanephrinu (M) a normetanephrinu (NM) z plazmy s využitím Oasis WCX μElution destiček na platformě Tecan, následované rychlou separací na ACQUITY UPLC BEH Amide kolóně a selektivní detekcí Xevo TQ MS v režimu MRM.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlá chromatografie byla provozována na systému ACQUITY UPLC s BEH Amide kolónou (1,7 μm, 2,1×50 mm) při teplotě 35 °C. Mobilní fáze A tvořil 100 mM amonný formiát (pH 3), fáze B acetonitril. Gradient přecházel z 2 na 35 % fáze A za 3 min, doba analýzy 5 min, průtok 200 μL/min. Detekce probíhala na Xevo TQ MS (ESI+, MRM, jednotkové rozlišení), přechody 180→148 pro M a 166→134 pro NM. Internal standardy: 2H3-M a 2H3-NM. Extrakce proběhla na Tecan Freedom EVO 100: kondice μElution destičky, nanesení vzorku s interním standardem, sekvenční praní (voda, methanol, 0,2 % kyselina mravenčí v acetonitrilu) a eluční kroky (2×50 μL 2 % kyselina mravenčí v acetonitrilu).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LLOQ S:N>10 na úrovni 45 pmol/L pro M a 127 pmol/L pro NM; LOD stanovené při S:N>5 byly poloviční. Vnitrobatchová a mezibatchová variabilita (CV) byly <7,6 % (M) a <5,6 % (NM) resp. <7,5 % a <12,8 %. Linearita detektoru byla potvrzena do 24,55 nmol/L (R2>0,995). Průměrná výtěžnost SPE činila 97 % (M) a 95 % (NM). Matricové efekty byly kompenzovány interním standardem, netto iontové zvýšení 4,0 % (M) a 0,3 % (NM). Porovnání s online SPE LC–MS/MS prokázalo shodu bez významného biasu pro M a mírný (15 %) bias pro NM nad 1 070 pmol/L, v rámci referenčního intervalu nevýznamný.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení manuálních operací a chybovosti díky plné automatizaci SPE.
• Zvýšení throughputu potravou destičkového formátu a zkrácení doby analýzy na 5,5 min mezi vstřiky.
• Vysoká analytická specifita a citlivost vhodná pro klinický výzkum a diagnostiku.
• Eliminace kroků odpařování a rekonstrukce vzorku po extrakci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizovaných SPE postupů na další polarizované anality v klinické a průmyslové praxi, integrace online/offline systémů s vyšší kapacitou destiček a nasazení pokročilých AI řízených protokolů pro prediktivní údržbu a optimalizaci procesů.

Závěr

Navržená metoda kombinuje offline automatizovanou WCX μElution SPE s rychlou UPLC–MS/MS analýzou, což umožňuje spolehlivou, vysoce výkonnou a reprodukovatelnou kvantifikaci metanephrinu a normetanephrinu v plazmě s minimálním operátorským zásahem.

Reference

• Lenders JW et al. Determination of metanephrines in plasma by liquid chromatography with electrochemical detection. Clin Chem 1993;39(1):97–103.
• De Jong WHA et al. Plasma free metanephrine measurement using automated online solid-phase extraction HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2007;53(9):1684–1693.
• Clarke MW et al. Improved plasma free metadrenaline analysis requires mixed mode cation exchange solid-phase extraction prior to liquid chromatography tandem mass spectrometry. Ann Clin Biochem 2011;48:352–357.