Innovator and Biosimilar Monoclonal Antibody-Peptide Map Comparison Using the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System and Agilent MatchCompare Software

Význam tématu

Charakterizace posttranslačních modifikací (PTM) u monoklonálních protilátek je zásadní pro udržení jejich stability, účinnosti a bezpečnosti. Porovnání peptide map inovátorských a biosimilárních látek pomáhá odhalit drobné rozdíly ve struktuře a modifikacích, které mohou ovlivnit farmakologické vlastnosti.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat použití Agilent 7100 Capillary Electrophoresis systému pro analýzu tryptických štěpů rituximabu (inovátor i biosimilár) a následné porovnání peptide map pomocí softwaru Agilent MatchCompare. Hodnotí se separační schopnost, reprodukovatelnost a míra podobnosti dvou vzorků.

Použitá metodika

Různé kroky přípravy vzorku:

• Denaturace v 6 M ureu, 25 mM NH4HCO3, pH 8,0
• Redukce 10 mM DTT, 1 h při 37 °C
• Alkylace 40 mM iodoacetamidem v tmě, 1 h při 37 °C, následné znehybnění DTT
• Trypsinová digesce (enzym : protein 1 : 20) přes noc při 37 °C
• Acidifikace TFA, desalting pomocí ZipTipC18

Podmínky CZE:

• Kapilára: holé fused-silica, 65 cm délka celkem, 56 cm efektivní, 50 μm id
• Elektrolyt: 50 mM fosfát pH 2,5 + 0,05 % hydroxyl ethyl cellulose
• Napětí: +25 kV, teplota 25 °C
• Injekce: hydrodynamická 25 s při 50 mbar
• Detekce: DAD 200 nm/16 nm, referenční 360 nm/100 nm

Použitá instrumentace

Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System (G7100A)
Agilent OpenLAB CDS ChemStation C.01.07
Agilent MatchCompare A.01.02

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza rozštěpených peptidů odhalila cca 60 signálních pásů se separací mezi 10 až 35 min. Reprodukovatelnost migrace dosahovala RSD ≤ 2,1 % a peak area RSD ≤ 12,1 % pro čtyři vybrané vrcholy. Software MatchCompare vygeneroval podobnostní skóre 0,9782 mezi inovátorem a biosimilárem. Overlay chromatogramů poukázal na rozdíly v intenzitě vybraných vrcholů a přítomnost nových pásů v biosimilárním vzorku, což odpovídá drobným změnám v PTM (např. lysinová truncace, oxidace, deamidace).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou separační účinnost
• Nízkou spotřebu vzorku a pufru
• Rychlou a reprodukovatelnou analýzu peptide map
• Automatizovanou objektivní komparaci pomocí MatchCompare
• Uplatnění v R&D i ve výrobní kontrole (QC) biosimilárů

Budoucí trendy a možnosti využití

Kombinace CZE s hmotnostní spektrometrií (CE-MS) pro detailní identifikaci modifikací Pevnější integrace automatizace a AI-návrhů analýz Rozšíření databází peptide fingerprintů pro rychlý screening variant Integrace do kontrolních procesů in-line a on-line monitoring výrobních dávek

Závěr

Agilent 7100 CE systém s MatchCompare softwarovou podporou prokázal schopnost rychle a spolehlivě porovnat peptide mapy inovátorského a biosimilárního rituximabu. Metoda poskytuje cenné informace o strukturálních odchylkách a pomáhá zajišťovat kvalitu a srovnatelnost bioterapeutik.

Reference

1. Jefferies R. Posttranslační modifikace a imunogenicita bioterapeutik. Journal of Immunology Research. 2016.
2. Sekhon B. Přehled kapilární elektroforézy v biofarmaceutické aplikaci. Journal of Pharmaceutical Education and Research. 2011;2(2):2.
3. Agilent Technologies. OpenLAB CDS MatchCompare for Chromatographic Peak Matching and Comparison. Data Sheet 5991-2553EN, 2013.
4. Andrási G. Analýza rituximabu kapilární zónovou elektroforézou. Journal of Chromatography & Separation Techniques. 2014;6:259.
5. Babu CV. Analýza náboje rituximabu inovátora a biosimilárního mAb. Agilent Application Note 5991-5557EN, 2015.
6. Gudihal R. Peptide mapping inovátora a biosimiláru mAb pomocí Agilent 1290 Infinity UHPLC-MS. Agilent Application Note 5991-6522EN, 2016.
7. Klein J. Porovnání CE-MS/MS a LC-MS/MS sekvenování peptidů. Electrophoresis. 2014;35:1060–1064.
8. Babu CV. CE/MS a LC/MS synergie v peptide mappingu. Agilent Note 5991-2583EN, 2013.
9. Agilent Technologies. OpenLAB CDS MatchCompare Tech Flyer. Data Sheet 5991-6346EN, 2015.