UHPLC-MS/MS Triple Quadrupole Analysis of Anthocyanin Metabolites in Human Plasma Using Protein Precipitation and Solid Phase Extraction For Determination of Uptake from Food

Význam tématu

Analýza metabolitů anthokyaninů v lidské plazmě umožňuje hodnotit biologickou dostupnost a účinky těchto polyfenolů po konzumaci potravin bohatých na barviva. Přesné stanovení pomáhá výzkumu nutriční farmakokinetiky a přispívá k objasnění role anthokyaninů ve zdraví člověka.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout citlivou metodu pro kvantifikaci pěti anthokyaninů a jejich metabolitu v lidské plazmě po požití jahodového nápoje obsahujícího lyofilizované práškové jahody. Studie zahrnovala srovnání dvou přípravných technik vzorků: srážení bílkovin (PPT) a extrakci na pevné fázi (SPE).

Použitá metodika

Vzorky plazmy odebraného v čase 0, 2 a 3 hodiny po konzumaci nápoje byly připraveny dvěma způsoby

1. PPT – přidání kyselinou upraveného acetonitrilu, chlazení, odstředění a odpaření supernatantu
2. SPE – ředění vzorku, naložení na kartridže Bond Elut Plexa, promytí vodou a eluace kyselinou upraveným methanolem

Pro chromatografickou analýzu byla použita UHPLC Agilent 1290 Infinity a detekce na triple kvadrupolu Agilent 6460 MS/MS s MRM režimem. Separation na C18 kolonce a gradientní eluce mobilní fází s formic acidou zajišťovaly rozlišení analyzovaných sloučenin.

Použitá instrumentace

• UHPLC Agilent 1290 Infinity Binary Pump a Autosampler
• Thermostatted Column Compartment
• Agilent 6460 Triple Quadrupole MS/MS s ESI pozitivní ionizací a Jet stream technologii
• Agilent Bond Elut Plexa SPE kartridže

Hlavní výsledky a diskuse

SPE vzorky byly vizuálně čistší než PPT a dosahovaly vyššího výtěžku analytů (60,8 až 121,1 procent) oproti PPT (4,2 až 18,4 procent). Nejvyšší koncentrace metabolitů byla zaznamenána ve 2. hodině po konzumaci. U P3G a pelargonidin glucuronidu byl statisticky významně vyšší obsah ve SPE ve srovnání s PPT. Chromatogramy prokázaly dostatečné rozlišení, i když u P3G a metabolitu existovalo drobné překrytí retencí, což kompenzovala selektivita MRM přechodů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost pro analýzu stopových koncentrací anthokyaninů v komplexních matricích. SPE příprava zajišťuje reprodukovatelné čištění a koncentrování vzorku. Vhodné pro klinické studie bioavailability, nutriční výzkum a kontrolu kvality potravinových doplňků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vývoj dalších speciálních sorbentů pro SPE s lepší selektivitou pro polyfenoly, využití stabilních izotopických interních standardů a aplikace vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie pro přesnější identifikaci neznámých metabolitů. Kombinace s možností online SPE a automatizace zrychlí rutinní analýzy.

Závěr

Optimalizovaná UHPLC-MS/MS metoda s využitím SPE přípravy vzorků poskytuje citlivé a přesné stanovení anthokyaninů a jejich metabolitu v lidské plazmě. SPE výrazně zlepšuje recovery a čistotu vzorku ve srovnání s běžným srážením bílkovin.

Reference

1. Horbowicz M Kosson R Grzesiuk A Dębski H Anthocyanins of Fruits and Vegetables Their Occurrence Analysis and Role in Human Nutrition Vegetable Crops Research Bulletin 5 2008
2. Tanaka Y Sasaki N Ohmiya A Biosynthesis of plant pigments anthocyanins betalains and carotenoids The Plant journal for cell and molecular biology 54 4 733 49 2008
3. Basu A et al Strawberry as a functional food an evidence based review Critical reviews in food science and nutrition 54 6 790 806 2014
4. da Silva FL et al Anthocyanin pigments in strawberry LWT Food Science and Technology 40 2 374 82 2007
5. Edirisinghe I et al Strawberry anthocyanin and its association with postprandial inflammation and insulin Br J Nutr 106 6 913 22 2011