Demonstrating Method Equivalency of the ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System and an ACQUITY UPLC I-Class PLUS System Through Method Transfer of a Reversed-Phase Peptide Mapping Method

Význam tématu

Reverse-phase peptide mapping představuje klíčovou analytickou metodu pro detailní charakterizaci biotherapeutických proteinů. Umožňuje systematickou identifikaci a kvantifikaci peptidových fragmentů po enzymatické štěpné reakci, což je nezbytné pro zajištění konzistence kvality, stability a bezpečnosti léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit vzájemnou ekvivalenci metody RPLC peptide mappingu při přenosu z ACQUITY UPLC I-Class PLUS System na novou biokompatibilní ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System. Studie se zaměřila na porovnání reprodukovatelnosti retenčních časů a velikosti píků mezi oběma systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: tryptický digest NIST mAb standardu ve formiátovém pufru, 0,5 µg/µl.
Kolona: BEH C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1×100 mm, teplota 60 °C.
Mobilní fáze A: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě; fáze B: 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu.
Gradient: lineární program podle původní metody, průtok 0,5 ml/min, objem injekce 10 µl, detekce při 214 nm.
Data management: Empower 3 FR4.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS System (nerezová fluidika)
• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System (biokompatibilní fluidika)
• ACQUITY UPLC BEH C18 kolona 2,1×100 mm
• Empower 3 FR4 chromatografický software

Hlavní výsledky a diskuse

Při standardní konfiguraci obou systémů se průměrný rozdíl retenčních časů 13 vybraných peptidů pohyboval kolem 1,5 s (odpovídá 12,5 µl rozdílu v dwell volume). Statistická analýza prokázala vysokou přesnost intra-systémových měření (SD 0,0012–0,0017 min).
Ve variantě s rozšířeným 340 µl mixérem došlo k posunu retence, který byl koregován funkcí Gradient SmartStart – posunutím zahájení gradientu o odpovídající objem. Po aplikaci korekce bylo dosaženo lineární závislosti retenčních časů mezi platformami s R2 = 0,99996. Rozdíly v relativních plochách piků nepřesahovaly 1 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje bez nutnosti úprav gradientního programu přesun analytických postupů mezi různými UPLC platformami. Gradient SmartStart zkracuje čas na validaci přenesené metody a minimalizuje riziko chyb způsobených rozdíly v dwell volume. Biokompatibilní systém H-Class Bio přináší vyšší odolnost vůči proteinovým vzorkům.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení biokompatibilních LC systémů pro komplexní proteomické aplikace a vyšší modifikované konjugáty. Automatizované nástroje pro korekci retenčních časů a integrace do LIMS rozšíří možnosti standardizace mezi laboratořemi. Metoda se dále uplatní pro IEX, SEC a vícedimenzionální chromatografii.

Závěr

Studie potvrdila, že ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System dosahuje ekvivalentních výsledků oproti I-Class PLUS Systemu. Gradient SmartStart efektivně kompenzuje rozdíly v dwell volume, což zajišťuje konzistentní retence a kvantitativní přesnost při přenosu metody.

Reference

• Hong P., McConville P.R. Dwell Volume and Extra-Column Volume: What Are They and How Do They Impact Method Transfer. Waters White Paper, 2016.
• Dao D., Birdsall R.E., Yu Y.Q. Instrument Mixer Considerations to Improve Assay Reproducibility and Sensitivity. Waters Application Note, 2020.