Identification of the modified amino acid residue in the modified heme protein using LC/MS/MS

Význam tématu

Oxidace aminokyselin v hemoproteinech může zásadně ovlivnit jejich biologickou funkci a stabilitu. Identifikace přesné pozice modifikace je klíčová pro pochopení mechanismů poškození proteinu působením peroxidů a pro optimalizaci analytických metod v biochemii, farmaceutickém výzkumu a kontroly kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo lokalizovat a identifikovat modifikované aminokyseliny v mutantní formě hemoproteinu, zčásti oxidované peroxidem vodíku. Autorky analyzovaly míchánek nepoškozeného a oxidovaného proteinu (cca 50 % oxidace) pomocí tryptického štěpení a následné analýzy LC/MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup zahrnoval:

• Enzymatickou digesci trypsinem
• Předběžnou ESI-TOF analýzu (JMS-T100LC AccuTOF, JEOL)
• UHPLC separaci na Nexera systému (Shimadzu) se sloupcem Shim-pack XR-ODS II (150×2,0 mm, 2,2 μm)
• Eluční gradient 0,1% kyselina mravenčí (A) vs acetonitril (B), průtok 0,2 mL/min, 40 °C
• Detekci na LCMS-8030 triple kvadrupólu (Shimadzu) s ESI zdrojem v pozitivním režimu
• Parametry MS: DL teplota 250 °C, nebulizér 2,0 L/min, sušící plyn 15 L/min
• Product ion scan s třemi energiími kolize (15, 30, 45 V)

Hlavní výsledky a diskuse

• ESC-TOF odhalil dva izobarické peptidy F2 (IFIMK) a F8 (MIFIK) m/z 651 (M+H) a nový signál m/z 667 (+16 u), indikující oxidovanou formu.
• LC/MS rozlišení dvou dvou-násobně nabitých špiček m/z 326,4 a oxidované formy m/z 334,4 umožnilo jejich separaci podle retenčního času.
• MS/MS produktové ionty při CE 15 V poskytly klíčové imonium ionty a fragmentační vzory pro sekvenční určení:
• 326,4 @ RT 13,7 min → IFIMK (F2)
• 326,4 @ RT 14,5 min → MIFIK (F8)
• 334,4 @ RT 11,6 min → oxidovaný MIF(O)IK (modifikovaný F8)
• Byla potvrzena sulfoxidace methioninu v peptidu F8 jako modifikovaná aminoskupina.
• Ultra high-speed scanning LCMS-8030 umožnil získání dostatečného počtu datových bodů i při full scanu a opakovaných product ion snímáních.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesné mapování posttranslačních modifikací v proteinech.
• Rychlá lokalizace a identifikace oxidovaných zbytků, užitečné pro biochemický výzkum i QA/QC procesy.
• Možnost aplikace při vývoji biotechnologických produktů a studiu oxidative stress v biologických systémech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace vyššího rozlišení a kvantitativní analýzy posttranslačních modifikací.
• Rozšíření metodiky na další oxidativní změny aminokyselin (tryptofan, cystein).
• Automatizace zpracování dat a integrace s bioinformatickými nástroji pro proteomiku.

Závěr

Study potvrdila, že kombinace UHPLC a LC/MS/MS s rychlým product ion skenováním je účinným nástrojem pro identifikaci modifikovaných aminokyselin v hemoproteinech. Metoda umožnila přesně lokalizovat oxidovaný methionin v peptidu MIF(O)IK a demonstrovala výhody vysokorychlostní analýzy.

Reference

• Ando Y., Matsumoto K., Watanabe J., Iida J., Hirota S. Identification of the modified amino acid residue in the modified heme protein using LC/MS/MS. ASMS 2012.