SOLUTIONS THAT MEET YOUR DEMANDS FOR FORENSIC TOXICOLOGY

Význam tématu

Cocaine je dopravní a zdravotní problém spojený se zneužíváním, jehož hlavní detekčními markery v biologických vzorcích jsou benzoylecgonine (BE) a cocaethylene (CE). Rychlá a spolehlivá analýza těchto látek v moči je zásadní pro forenzní toxikologii, klinický monitoring i pro potvrzení výsledků screeningových testů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a validovat rychlou, citlivou a jednoduchou metodu pro kvantitativní stanovení kokainu, BE a CE v moči, která nahradí náročné derivatizační GC/MS protokoly. Metoda využívá pevnou fázi extrakci a detekci pomocí LC/MS v režimu SIM bez potřeby chemické derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moče (1 mL) byly vystaveny SPE extrakci (Clean-Screen, ZSDAU020) s následujícím protokolem:

• kondicionace: 3 mL methanol, 3 mL deionizované vody, 1 mL 100 mM fosfátového pufru (pH 6)
• nanesení vzorku smíchaného s 1 mL pufru + D3 interní standardy
• proplach: 2 mL vody, 2 mL 100 mM HCl, 3 mL methanolu
• eluce: 3 mL CH2Cl2/isopropanol/amoniak (78:20:2)
• odsušení při 40 °C a rekognstituce v 50 µL mobilní fáze

Chromatografie na HPLC Agilent 1100 Series:

• kolona: Metasil Basic C18, 3 × 150 mm, 3 µm
• isokratický režim: 51 % methanolu, 49 % 0,1 % formiátu amonného (pH ~4)
• rychlost průtoku: 0,2 mL/min, teplota kolony 40 °C, injekce 20 µL

Detekce na LC/MSD VL:

• ESI+, Vcap 1500 V, suchý plyn 10 L/min při 300 °C, nebulizér 20 psig
• SIM monitoring: m/z 304.1 (kokain), 307.1 (kokain-d3), 290.1 (BE/norkokain), 293.1 (BE-d3)
• fragmentor 70 V

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla lineární kalibrace:

• kokain 25–1000 ng/mL, BE 25–1000 ng/mL, CE 10–500 ng/mL

Sensitivita:

• LOD = 5 ng/mL (kokain, BE), 2 ng/mL (CE); LOQ = 25 ng/mL (kokain, BE), 10 ng/mL (CE)

Opakovatelnost (n=10):

• kokain (50 ng/mL): CV 7,1 %, přesnost –12 %
• BE (150 ng/mL): CV 5,1 %, přesnost –3 %

V pozitivním vzorku bylo naměřeno:

• kokain: 640 ng/mL
• BE: ~2700 ng/mL (nad kalibrovací rozsah)
• norcocaine: rozpoznáno chromatograficky odděleně od BE

Přínosy a praktické využití metody

Metoda:

• nevyžaduje derivatizaci – šetří čas a eliminuje agresivní činidla
• jedna SPE extrakce pokrývá kokain i hlavní metabolity
• rychlá isokratická analýza (6 min / injekce)
• vysoká citlivost a selektivita díky SIM LC/MS

Metoda je vhodná pro forenzní a klinické laboratoře, kde je žádoucí jednoduchý workflow a minimalizace zásahů do analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další metabolity a omamné látky
• Nasazení LC/MS/MS (triple quad) pro ještě vyšší citlivost a přesnost kvantifikace
• Automatizované SPE vzorkování a 96-well formáty
• Screeningové metody v režimu full scan a HRMS (QTOF) pro detekci neznámých látek

Závěr

Vyvinutá LC/MS metoda pro kokain a jeho metabolity v moči nabízí rychlý, citlivý a reprodukovatelný přístup bez derivatizace. Kombinace jednoduché SPE extrakce a SIM LC/MS analýzy zkracuje čas metody, snižuje variabilitu a umožňuje spolehlivou kvantifikaci a identifikaci.

Reference

• Crouch D.J., et al. J. Anal. Toxicol. 1995, 19, 352–358.
• Slawson M.H., Crouch D.J., Andrenyak D.M. J. Anal. Toxicol. 1999, 23, 468–473.
• DeBoeck G., Wood M., Samyn N. LCGC Europe, Nov 2002.
• Pichini S., et al. J. Chromatogr. B 2003, 794, 281–292.