Method Transfer and Reliability of the ACQUITY Arc for Peptide Mapping

Význam tématu

Ve výrobě biotechnologických léčiv má podrobná charakterizace aminokyselinové sekvence proteinů zásadní význam pro zajištění jejich identity, stability a kvality. Peptidové mapování se stalo standardní platformní metodou k odhalení posttranslačních modifikací a potvrzení konzistence šarží během vývoje a komercializace léčiv. Efektivní přenesení a validace těchto analytických metod mezi různými kapalinovými chromatografy je klíčové pro spolehlivost výsledků a optimalizaci pracovních postupů v laboratořích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat možnost přímého převodu peptidové metody z tradičního HPLC systému Agilent 1100 Series na platformu ACQUITY Arc bez změny metodických parametrů a posoudit systematickou reprodukovatelnost mezi dvěma samostatnými jednotkami ACQUITY Arc. Dále bylo sledováno zlepšení rozlišení a kapacity separace při přechodu z 3,5 µm na 2,5 µm částice a integrace hmotnostní detekce pomocí QDa detektoru.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: Infliximab redukovaný DTT, alkylovaný iodoacetamidem, digesto trypsinem (1:20) při 37 °C po dobu 18 hodin; deaktivace TFA.
• Chromatografy: Agilent 1100 Series HPLC se čtyřkanálovým čerpadlem a DAD; ACQUITY Arc System s 2489 UV/Vis detektorem a QDa detektorem, konfigurace s pasivním preheaterem 30 cm.
• Kolony: XBridge BEH C18 130 Å (4,6 × 100 mm), 3,5 µm a XBridge BEH C18 XP 130 Å (4,6 × 100 mm), 2,5 µm.
• Mobilní fáze: A – voda s 0,1 % TFA, B – acetonitril s 0,1 % TFA; gradient 60 minut, tok 0,5 mL/min, teplota kolony 40 °C.
• Detekce: UV/Vis při 214 nm, vzorkovací frekvence 20 Hz; QDa – rozsah 350–1250 Da, vzorkovací frekvence 2 Hz, kuželové napětí 10 V, kapilární napětí 1,5 kV.
• Software: Empower 3 CDS SR2 pro akvizici a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda byla bez úprav přenesena na ACQUITY Arc s využitím Gradient SmartStart k vyrovnání rozdílů v objemu prodlevy; chromatogramy z obou systémů se velmi shodovaly a rozdíly v relativních retenčních časech ΔRRT nepřesáhly 0,014.
• Srovnání dvou samostatných jednotek ACQUITY Arc potvrdilo systematickou opakovatelnost s rozdíly RRT do 0,006, což zvyšuje důvěru při nasazení více platforem.
• Přechod na kolonu s částicemi 2,5 µm při zachování 60minutového běhu vedl k vyššímu rozlišení a kapacitě separace bez změny gradientu.
• Integrace QDa detektoru přidala komplementární hmotnostní údaje, např. detekce nabitých stavů modelového peptidu (897,9 Da a 599,1 Da), což zvyšuje spolehlivost potvrzení identity.

Přínosy a praktické využití metody

Peptidové mapování na platformě ACQUITY Arc umožňuje laboratořím:

• bezproblémový převod standardních HPLC metod na moderní LC/UHPLC platformu,
• spolehlivou reprodukovatelnost výsledků napříč více instrumenty a lokalitami,
• zvýšené rozlišení díky menšímu průměru částic,
• rutiní hmotnostní detekci pro rychlejší potvrzení identity a sledování QC kritérií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přenosu metod mezi laboratořemi s automatickým vyrovnáváním gradientů.
• Rozšíření aplikace hmotnostní detekce pro monitoring post-translačních modifikací.
• Integrace s platformami pro pokročilou analýzu dat a strojové učení.
• Optimalizace kratších běhů UHPLC s využitím menších částic pro zvýšení propustnosti laboratoří.

Závěr

Studie prokázala, že ACQUITY Arc reprodukuje HPLC metody bez úprav parametrů a zároveň umožňuje modernizaci postupů směrem k UHPLC. Konzistence výsledků na různých systémech a přidání QDa hmotnostní detekce výrazně posilují spolehlivost peptidového mapování v biopharmaceutické analýze.

Reference

1. Koshel BM, McCarthy SM. Transfer of an SEC Method for Monoclonal Antibody Analysis from HPLC to UHPLC using the ACQUITY Arc System. Waters Corporation Application Note 720005510en (2015).
2. Koshel BM, McCarthy SM. IEX Method Transfer: Replicating a Method for Monoclonal Antibody Analysis on an ACQUITY Arc System. Waters Corporation Application Note 720005529en (2015).
3. Luo Y et al. Handbook of Modern Pharmaceutical Analysis. In: Separation Science and Technology; Ahuja S, Scypinski S, eds. Academic Press, Burlington, MA, 2010; Vol. 10: 283–359.
4. U.S. Pharmacopeial Convention. General Chapter 1055 Biotechnology-Derived Articles–Peptide Mapping. USP38–NF33, Official from August 1, 2015.
5. Hong P, McConville PR. Method Transfer from Agilent 1100 Series LC System to the ACQUITY UPLC H-Class System: The Effect of Temperature. Waters Corporation Application Note 720005204en (2015).
6. Waters Corporation. ACQUITY Arc System Brochure. Waters Corporation, 720005393en (2015).