Transferring RapiFluor-MS Labeled N-Glycan HILIC Separations Between UPLC and HPLC

Význam tématu

N-glykany jsou nedílnou součástí glykoproteinů a jejich detailní analýza je klíčová pro pochopení biologické aktivity, stability a imunogenity biopharmak. HILIC chromatografie s označením RapiFluor-MS nabízí citlivou detekci pomocí fluorescence i hmotové spektrometrie. Schopnost přenášet metody mezi UPLC a HPLC platformami zajišťuje širokou aplikovatelnost v laboratořích s různými nástrojovými kapacitami.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat bezproblémovou škálovatelnost a přenos separací RapiFluor-MS označených N-glykanů mezi UPLC a HPLC kompatibilními podmínkami. Autoři zkoumali vliv částic o velikosti 1,7 a 2,5 µm, úprav délky a vnitřního průměru kolony a optimalizovali chromatografické parametry tak, aby byla zachována rozlišovací schopnost a kvantitativní přesnost.

Použitá metodika a instrumentace

Pro UPLC separace byla využita kolona ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 1,7 µm 2,1×150 mm na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio. Pro HPLC přenos byla použita sestava XBridge Glycan BEH Amide XP 2,5 µm 3,0×(150+75) mm na systému Alliance HPLC. Detekce probíhala fluorescencí (λex 265 nm, λem 425 nm). Mobilní fáze tvořil pufr ammonium formiát pH 4,4 a acetonitril v gradientu optimalizovaném pro oba formáty. Vzorkem byl standard RapiFluor-MS Glycan Performance Test Standard koncentrace 20 pmol/µl.

Hlavní výsledky a diskuse

Při přenosu metody mezi UPLC a HPLC byly podle pravidla L/dp zvoleny odpovídající délky a průměry kolon. HPLC formát na kolóně 3,0 mm×225 mm dosáhl podobných chromatogramů jako UPLC na 2,1 mm×150 mm, přičemž doba analýzy se zkrátila u UPLC o více než 55 %, spotřeba mobilní fáze o více než 68 % a požadované množství vzorku kleslo o více než 68 %. Relativní retence 21 nejhojnějších glykanů se lišily v průměru do 5 %, což potvrzuje chemickou ekvivalentnost částic a stabilitu separační selektivity.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost volby mezi vysokou propustností UPLC a dostupností HPLC bez kompromisů v kvalitě separace
• Snížená spotřeba vzorku a mobilní fáze při UPLC umožňuje ekonomičtější provoz
• Flexibilní škálování pro frakcionaci a přípravu glykanů ke strukturním analýzám či validaci metod

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj v oblasti miniaturizace HILIC kolonu, nové reagencie pro rychlejší značení a zvyšování citlivosti MS detekce. Integrace automatizovaných platform pro přípravu vzorků a vícerozměrných separací doplněných pokročilou datovou analýzou podpořenou umělou inteligencí otevře nové možnosti glykomiky.

Závěr

Studie potvrdila, že přenos metod HILIC separace RapiFluor-MS označených N-glykanů mezi UPLC a HPLC je snadno realizovatelný při zachování rozlišovací schopnosti a kvantitativní přesnosti. Laboratoře tak mohou optimalizovat workflow podle dostupného vybavení a požadavků na průtok vzorku, spotřebu rozpouštědel či dobu analýzy.

Reference

1. B Gillece-Castro, K van Tran, J E Turner, T E Wheat, D M Diehl N-Linked Glycans of Glycoproteins A New Column for Improved Resolution Waters Application Note 720003112en 2009
2. M A Lauber, S M Koza, J E Turner, P C Iraneta, K J Fountain Amide-Bonded BEH HILIC Columns for High Resolution HPLC-Compatible Separations of N-Glycans Waters Application Note 720004857en 2013
3. M A Lauber, D W Brousmiche, Z Hua, S M Koza, E Guthrie, P Magnelli, C H Taron, K J Fountain Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent Waters Application Note 720005275en 2015
4. U D Neue, D McCabe, V Ramesh, H Pappa, J DeMuth Transfer of HPLC procedures to suitable columns of reduced dimensions and particle sizes Pharmacopeial Forum 2009