Ultrasensitive Quantification Assay for Oxytocin in Human Plasma Using the ionKey/MS System

Význam tématu

Oxytocin je krátký cyklický peptide s klíčovými funkcemi v neurofyziologii a sociálním chování. Jeho koncentrace v lidské plazmě jsou velmi nízké (v řádu pg/mL), což vyžaduje vysoce citlivé a specifické analytické metody. Spolehlivé stanovení oxytocinu je nezbytné pro farmakokinetické studie, výzkum terapeutických peptidů a klinická hodnocení.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout ultrasenzitivní LC-MRM metodu na platformě ionKey/MS ke kvantifikaci oxytocinu v lidské plazmě s dolní mezí kvantifikace (LLOQ) 10 pg/mL. Studie demonstruje optimalizaci vzorkové přípravy, chromatografických podmínek a hmotnostní spektrometrie pro dosažení vysoké citlivosti, přesnosti a robustnosti.

Použitá metodika

Vzorek lidské plazmy (200 µL) byl fortifikován oxytocinem a izotopově značeným interním standardem. Proteinová precipitace acetonitrilem (1:1) následovala SPE na Oasis HLB 96-jamkové destičce. Extrakty se injektovaly v objemu 3 µL do kapilární chromatografie iKey BEH C18 (150 µm × 100 mm) při průtoku 3 µL/min s mobilními fázemi 0,1 % FA ve vodě (A) a 0,1 % FA v acetonitrilu (B). Detekce byla prováděna na Xevo TQ-S v režimu pozitivní ESI-MRM, přechod 1007,4 → 723,3 (b6 fragment) byl optimalizován na 100 V kuželové napětí a 28 V kolizní energii.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC M-Class System
• iKey BEH C18 Separation Device, 150 µm × 100 mm
• Xevo TQ-S Mass Spectrometer s ionKey Source
• Oasis HLB 96-well Plates
• MassLynx Software a TargetLynx Application Manager
• RapiGest pro testování proteinového vázání

Hlavní výsledky a diskuse

Full scan ESI-MS ukázal, že dominantním prekurzorem oxytocinu je jednonásobně nabitý ion m/z 1007,4, nikoli očekávaný dvounásobně nabitý ion. Recoverie analyzátu z proteinově precipitované plazmy dosahovaly 70–85 % bez použití denaturantů, což naznačuje minimální proteinové vázání. Metoda dosáhla LLOQ 10 pg/mL s RSD 13,2 % při desetičetných replikátech. Lineární rozsah 10–20 000 pg/mL vykázal koeficient determinace r² = 0,998. Carryover byl velmi nízký (0,02 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost vhodná pro farmakokinetiku a bioanalýzu peptidů
• Snížená spotřeba mobilních fází (až 100× úspora nákladů)
• Zvýšená robustnost díky kombinaci precipitace a SPE
• Kompatibilita s vysokopropustnými 96-jamkovými destičkami

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se aplikace kapilární LC-MS metod na další terapeutické peptidy a biomarkery. Integrace s dvoudimenzionální chromatografií, automatizace vzorkové přípravy a rozvoj mikrofluidických systémů mohou dále zvýšit citlivost, throughput a reproducibilitu.

Závěr

Vyvinutá metoda na platformě ionKey/MS poskytuje rychlou, přesnou a ultrasenzitivní kvantifikaci oxytocinu v lidské plazmě. Díky minimálnímu carryover, širokému lineárnímu rozsahu a úsporám nákladů představuje efektivní řešení pro bioanalytickou podporu vývoje peptidových léčiv.

Reference

1. Burd JM, Weightman DR, Baylis PH. J Immunoassay. 1985;6(3):227–43.
2. Fisher LA, Fernstrom JD. Life Sci. 1981;28(13):1471–81.
3. Cool DR, DeBroose D. J Chromatogr B. 2003;792(2):375–80.
4. Zhang G, Zhang Y, Fast DM, Lin Z, Steenwyk R. Anal Biochem. 2011;416(1):45–52.
5. Sobhi HR, Vatansever B, Wortmann A, Grouzmann E, Rochat B. J Chromatogr A. 2011;1218(47):8536–43.
6. Mabrouk OS, Kennedy RT. J Neurosci Methods. 2012;209(1):127–33.