Determination of Isoflavones in Soybean by LC/MS/MS

Význam tématu

Isoflavony představují významnou skupinu fytochemikálií s estrogenovou aktivitou, kterou lze nalézt především v sójových produktech. Jejich stanovení je klíčové pro hodnocení nutričních vlastností potravin, sledování obsahu bioaktivních látek a aplikace v šlechtitelských programech zaměřených na odolnost rostlin vůči škůdcům a zajištění potravinové bezpečnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této Application Note je popsat citlivou, spolehlivou a rychlou metodu pro kvantifikaci sedmi isoflavonů (daidzin, glycitin, rutin, genistin, daidzein, glycitein, genistein) v sójových vzorcích pomocí kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS). Studie zahrnuje optimalizaci chromatografických i MS/MS parametrů a aplikaci na reálné vzorky dvou odrůd sójových semen.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: homogenizace sójových semen v kapalném dusíku, extrakce 2 g vzorku methanolem s 0,1 M HCl, sonikace, dvojí filtrace (papír + PTFE 0,45 µm), odpaření pod sníženým tlakem, doplnění na 2 mL methanolu.
• Kapalinová chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC; kolona ZORBAX Eclipse Plus C18 (2,1×100 mm, 1,8 µm); teplota 40 °C; injekční objem 1 µL; mobilní fáze A voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, B acetonitril; gradient od 90 % A k 10 % A v 6 minutách; průtok 0,3 mL/min; celková doba analýzy 9 minut.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6470 triple quadrupole LC/MS; pozitivní ionizace ESI; MRM s dvěma přechody pro každou sloučeninu (nejintenzivnější kvantifikační, druhý kvalifikační); capillary voltage 4 000 V; sheath gas 300 °C, 10 L/min; drying gas 300 °C, 10 L/min; nebulizer 20 psi; fragmentor a kolizní energie optimalizovány pro každou sloučeninu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční časy analyzovaných isoflavonů se pohybovaly v rozmezí 3,54–6,43 min, s dobrým rozlišením jednotlivých sloučenin.
• Kalibrační křivky vykázaly lineární odezvu v rozsazích 0,01–5 ppm s koeficienty determinace vyššími než 0,998 a opakovatelností RSD 0,2–3,6 %.
• Mez detekce (LOD) se pohybovaly mezi 0,7 a 6,7 ppb, mez kvantifikace (LOQ) mezi 2,3 a 22,5 ppb.
• Aplikace na vzorky odrůd Silvania (vnímavá) a Dowling (rezistentní) potvrdila vyšší obsah isoflavonů v Silvanii s RSD nižším než 10,2 % a průměrným obsahem v řádu µg/g sušiny.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda kombinuje krátký čas analýzy pod 9 minut, jednoduchou přípravu vzorku a vysokou citlivost a přesnost. Je vhodná pro rutinní laboratorní vyšetření potravin, kontrolu kvality (QA/QC) i výzkumné účely při sledování bioaktivních složek v rostlinných matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace extrakčního procesu a vysokopropustné experimenty pro zkrácení doby přípravy a zvýšení reproducibility.
• Miniaturizace a integrace s mikrofluidními platformami pro on-line monitoring kvality potravin.
• Rozšíření metody na další matice, například biologické tekutiny či komplexní potravinové směsi.
• Aplikace chemometrických nástrojů a metabolomických přístupů pro komplexní profilaci fytoestrogenů a jejich metabolitů.

Závěr

Metoda LC/MS/MS popsaná v této Application Note prokázala vynikající analytické parametry při stanovení sedmi isoflavonů v sójových vzorcích. Díky jednoduchosti, rychlosti a vysoké citlivosti nabízí široké využití v potravinářských laboratořích i výzkumných institucích.

Reference

1. Mujić I et al. Isoflavone content and antioxidant properties of soybean seeds. Croat J Food Sci Technol 2011;3(1):16–20.
2. Anderson JJB et al. Health potential of soy isoflavones for menopausal women. Public Health Nutr 1999;2(4):489–504.
3. Wu Q, Wang M, Simon JE. Analytical methods to determine phytoestrogenic compounds. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2004;812(1–2):325–355.
4. Delgado-Zamarreño MM et al. A modified QuEChERS method as sample treatment before determination of isoflavones by UPLC–MS/MS. Talanta 2012;100:320–328.
5. Konar N et al. Determination of conjugated and free isoflavones in legumes by LC–MS/MS. J Food Compos Anal 2012;25(2):173–178.
6. Michereff MFF et al. Volatiles mediating plant–herbivory–natural enemy interaction in resistant and susceptible soybean cultivars. J Chem Ecol 2011;37(3):273–285.
7. Michereff MFF et al. Effect of resistant and susceptible soybean cultivars on nymphal development, fecundity and mortality of Euschistus heros (Hemiptera: Pentatomidae). Abstracts 1st American Latin Chemical Ecology Meeting, Uruguay 2010, p 138.