Purify Complex Samples with High Selectivity

Význam tématu

Zelený čaj patří mezi nejrozšířenější nápoje na světě a je významným zdrojem přírodních antioxidantů. Catechiny, hlavní flavan-3-oly v listech Camellia sinensis, přispívají k protizánětlivým a antioxidačním účinkům. Pro izolaci jednotlivých katechinů z komplexních přírodních matric je klíčové využití vysoce selektivních technik separace a detekce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat izolaci hlavních katechinů ze zeleného čaje pomocí Agilent 1260 Infinity II Analytical-Scale LC Purification System s hmotnostně selektivním detektorem (MSD) a frakčním sběračem ovládaným signálem MSD. Bylo testováno devět frakcí s aktivním odběrem založeným na SIM signálech pro cílové m/z hodnoty.

Metodika

Vzorek zeleného čaje se extrahoval 1 g suchých listů v acetonu:voda 1:1 po dobu dvou hodin za otřesu 750 rpm. Po centrifugaci a filtraci se vzorek chromatografoval na kolóně C18 (4,6×150 mm, 5 µm) gradientem 5–98 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí při průtoku 1,5 mL/min. UV detekce probíhala při 270 nm, MSD pracoval v módu SIM pro m/z 291,1; 307,1; 443,1 a 459,1. Aktivní split 1:100 a make-up flow 0,5 mL/min udržovaly konstantní složení pro optimální ionizaci. Frakce se automaticky shromažďovaly mezi 4,0 a 13,5 min při překročení prahové intenzity.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Quaternary Pump G7111B
• Agilent 1260 Infinity II Isocratic Pump G7110B
• Agilent 1260 Infinity II Vialsampler VL G7129A
• Agilent 1260 Infinity II Variable Wavelength Detector G7114A
• Agilent 1290 Infinity II MS Flow Modulator G7170B
• Agilent 1260 Infinity II Analytical-Scale Fraction Collector G1364F
• Agilent InfinityLab LC/MSD XT G6135B
• Agilent 6545 LC/Q-TOF pro přesné stanovení hmotností
• Kolona Agilent Pursuit XRs C18, 4,6×150 mm, 5 µm

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo shromážděno devět frakcí, z toho šest obsahovalo katechiny. Pět frakcí vykázalo čistotu ≥95 % (dvě frakce GC/EGC, CG/ECG a EGCG), jedna měla čistotu 83 % kvůli koliznímu přístupu kofein–katechin. Tři frakce vykazovaly nespecifické složky s podobnou hmotností, ale Q-TOF analýza je vyloučila jako katechiny. Výsledky potvrzují vyšší selektivitu odběru řízeného MSD ve srovnání s odběrem podle UV.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje izolaci vysoce čistých přírodních sloučenin i z velmi komplexních matic s minimální úpravou stávajícího LC/MS systému. Aktivní split zajišťuje flexibilní a reprodukovatelné přizpůsobení průtoku do MSD bez vlivu změn viskozity mobilní fáze. Výsledky jsou použitelné pro farmaceutickou, potravinářskou a environmentální analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího vývoje zahrnují propojení s multidimenzionální chromatografií pro hloubkovou charakterizaci přírodních extraktů, automatizované odběry frakcí podle definovaných hmotnostních profilů a rozšíření této strategie na jiné biologicky aktivní látky. Kombinace s pokročilou vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií může dále zlepšit identifikaci a uchování čistoty izolovaných sloučenin.

Závěr

Hmotnostně řízený frakční sběr s Agilent 1260 Infinity II LC a MSD umožnil selektivní izolaci hlavních katechinů ze zeleného čaje s vysokou čistotou. Výsledky demonstrují výhodu masově selektivního odběru frakcí u komplexních vzorků a přinášejí nový přístup pro rychlou a efektivní preparativní separaci přírodních antioxidantů.

Reference

1. Murkovic M. Phenolic Compounds: Occurrence, Classes, and Analysis. In Encyclopedia of Food and Health, Elsevier 2016.
2. Krieger S. Comprehensive 2D-LC Analysis of Tea (Camellia sinensis) with Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution, Agilent application note 5991-6059EN 2015.
3. Turkmen N et al. Effect of Extraction Conditions on Measured Total Polyphenol Contents and Antioxidant and Antibacterial Activities of Black Tea. Molecules 2007, 12(3), 484–496.