<h5>3.4 Rychlá plynová chromatografie</h5>
<h5>3.5 Miniaturizovaná plynová chromatografie</h5>
<h5>3.6 Vícerozměrná plynová chromatografie</h5>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Rychlá <a href="https://gcms.cz/article/3474">plynová chromatografie</a></h3>
Jak už tomu u nových analytických směrů bývá, terminologie není vždy plně sjednocena. Stejně tak tomu je i u rychlé plynové chromatografie. Termín „rychlá“ je používán ve dvou případech: (i) vzhledem k trvání celkové analýzy a (ii) vzhledem k vnitřnímu průměru analytických kolon. Ve srovnání s klasickou plynovou chromatografií má rychlá plynová chromatografie výrazně kratší celkovou dobu analýzy (obvykle &lt; 20 min).
Dalším používaným termínem je velmi rychlá plynová chromatografie (doba analýzy 1-3 min), hyper-rychlá (doba analýzy &lt; 1 min) a ultra-rychlá (doba analýzy &lt; 1 s). Redukce celkové doby analýzy u rychlé plynové chromatografie je docíleno použitím kolon (téměř výhradně kapilárních) s menším průměrem, nízkého tlaku na výstupu, a odporového ohřevu.
Nejpoužívanějšími kolony jsou na bázi micro- nebo narrow-bore. Oblíbená microbore kolona má rozměry 10 m × 0,10 mm I. D. × 0,10 μm df, její počet teoretických pater odpovídá 100 tis., což je ekvivalent kolony o rozměrech (25 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 mm df). Tyto kolony s ekvivalentním fázovým poměrem β umožňují plnou replikaci konvenčních metod ve značně zkráceném čase. Zmenšený vnitřní průměr navíc vede ke zvýšení účinnosti kolon. Hlavní nevýhodou je snížená kapacita vzorku.
Nízkotlaká plynová chromatografie, také známá jako vacuum-outlet GC, je charakterizována přímým napojením krátké analytické kolony se širokým vnitřním průměrem (5-10 m délky, s vnitřním průměrem 0,32 - 0,53 mm) k hmotnostnímu spektrometru. Hodnota optimální lineární rychlosti plynu se poměrně výrazně zvyšuje se zvýšením difúzního koeficientu analytu v mobilní fázi. Zvýšená lineární rychlost také vede k užším píkům a zlepšeným hodnotám signálu vs. šumu, což vede k nižším limitům detekce. Nízkotlaká plynová chromatografie nabízí další výhodu oproti analýze s atmosférickým výstupem, a to zejména nižší eluční teploty, které umožňují eluovat tepelně nestabilní a vysokovroucí sloučeniny při poměrně nízkých teplotách.
Odporový ohřev spočívá v použití elektricky vodivého pevného materiálu používaného jako zdroj ohřevu v přímém nebo těsném kontaktu s kolonou. Takové materiály jsou ohřívány elektricky a mohou vytvářet kladné a záporné teplotní gradienty (možnost zvýšit a/nebo snížit teplotu podél kolony). Kromě toho, nepoužívání konvenčního GC termostatu značně zjednodušuje konstrukci přenosných plynových chromatografů. Je důležité zmínit, že vysokorychlostní metody plynové chromatografie, bez ohledu na použitý přístup, vyžadují v ideálním případě nejen rychlý ohřev, ale také rychlé ochlazení na počáteční podmínky.
<h3>Miniaturizovaná plynová chromatografie</h3>
Koncept miniaturizované plynové chromatografie (μGC) představili Terry, Jerman a Angell ze Stanfordské univerzity v roce 1979. Posledních více jak 40 let se výzkum soustředí na vývoj této techniky. Důvodem je především provádění rychlých měření v potřebném místě (on-site). Zatímco konvenční plynový chromatograf, výkonný a všestranný nástroj, je relativně objemný a vyžaduje vysoký příkon (typickým požadavkem na špičkový příkon je 2–3 kW), a proto je obvykle nepřenosný v terénu. Není proto divu, že tento výzkum jde ruku v ruce s vývojem přenosných nebo ručních plynových chromatografů.
Názvosloví těchto miniaturizovaných zařízení není zcela sjednocené. Například přenosný model INFICON 3000 Micro GC váží 16,5 kg, Agilent 490 Micro GC (se 4 kanály) váží 10,6 kg a Vernier Mini GC Plus (vyvinutý společností Seacoast Science, Inc.) váží 1,3 kg, což naznačuje, že použití slova „mini“ nebo „mikro“ nejsou založeny na hmotnosti. Navíc použití termínu „mikro“ také není založeno na typu použité kolony, protože miniaturní GC systémy obsahující konvenční kapilární kolony jsou někdy nazývány jako mikro GC. μGC se skládá z řady komponent, včetně zdroje nosného plynu, prekoncentrátoru-injektoru, separační kolony, detektoru, čerpadla, ventilů a softwaru pro ovládání přístroje, sběr dat a analýzu. Princip fungování μGC je podobný jako u konvenčních GC, s tím rozdílem, že různé komponenty jsou miniaturizované, aby se zvýšila přenositelnost, snížila spotřeba energie a zvýšila rychlost analýzy.
Kolony - Konvenční kapilární kolony mají kruhový průřez, zatímco kolony na bázi čipů, známé jako mikrokolony, mají typicky obdélníkový průřez. Oba typy kolon byly aplikovány v μGC. Kapilární kolony s polyimidovou stacionární fází jsou nejvíce rozšířené. Hlavní výhodou kapilárních kolon je to, že pro danou plochu průřezu poskytují vyšší rozlišení díky homogennímu potažení filmu stacionární fáze po délce kolon. Mikrokolony nabízejí řadu výhod. Malá velikost mikrokolon umožňuje vysokou rychlost a nízký výkon ohřevu, monolitická integrace kolon s dalšími komponentami potenciálně minimalizuje mrtvý objem a studená místa; a výroba pravidelně uspořádaných nosných struktur uvnitř kanálů zvyšuje separační výkon. Hlavním omezením těchto kolon je však akumulace stacionární fáze v ostrých rozích (známá jako sdružovací efekt), což má za následek nestejnoměrnou tloušťku filmu uvnitř kolony, což vede k rozšíření píků. Nicméně v případě obdélníkových kolon s vysokým poměrem stran lze účinnost zvýšit zmenšením šířky kanálu a kapacitu vzorku a průtokovou rychlost lze zvýšit zvýšením výšky. Tím může být dosaženo lepší účinnosti ve srovnání s konvenčními kapilárními kolonami.
Detektory – Celá řada detektorů byla miniaturizovaná, aby mohla být použita v μGC. Jako příklad lze uvést TCD, PID, FID, ECD a celou řadu senzorů jako senzor s povrchovou akustickou vlnou, chemirezistory, chemicky kapacitní rezistory a další. Z hmotnostních spektrometrů se používá spektrometrie diferenciální pohyblivosti (DMS), jež je na bázi iontové pohyblivostní spektrometrie. DMS obsahuje dvě paralelní rovinné elektrody oddělené úzkou mezerou, kde jsou ionty transportovány proudem plynu, a pomocí radiofrekvenčního vysokého napětí. Při nízkých napětích je mobilita iontů nezávislá na poli, zatímco mobilita se stává závislou na poli při vysokých napětích. Pole osciluje mezi nízkými a vysokými poli, což má za následek separaci iontů, které jsou shromažďovány dvojicí elektrod. Pouze ionty s určitou pohyblivostí projdou.
<h3>Vícerozměrná plynová chromatografie</h3>
Plynová chromatografie se stala běžnou technikou pro separaci těkavých a polotěkavých organických sloučenin již od svého objevu v roce 1952 Martinem a Jamesem. Od počátku ale bylo zřejmé, že separační kapacita plynové chromatografie je omezená pro velmi složité směsi, jako je například ropa a její frakce. Proto již v roce 1958, Simmons a Snyder vyvinuli první dvoudimenzionální plynovou chromatografii (v tomto případě se jednalo o tzv. heart-cutting). Za dalších 33 let (1991, představili Liu a Phillips první ortogonální (komprehensivní) dvoudimenzionální (z ang. comprehensive two-dimensional) plynovou chromatografii. Terminologie těchto dvou technik, které v průběhu let získaly mnoho zkratek (např. 2D-GC, GC-GC, GC×GC a H/C MDGC), jsou někdy v kontextu nesprávně zaměňovány. Obecně se každá metoda plynové chromatografie, která využívá více než jednu kolonu, nazývá vícerozměrná plynová chromatografie (z ang. multidimensional gas chromatography, MDGC). Jestliže jsou použity kolony dvě, pak se tato technika označuje jako dvourozměrná plynová chromatografie (z ang. two-dimensional gas chromatography, 2D-GC). V dalším textu bude 2D-GC rozdělena do dvou hlavních kategorií: (1) heart-cutting 2D-GC (GC-GC) a (2) komprehensivní 2D-GC (GC×GC). Obě techniky se vyvinuly do dvou vyspělých, poněkud odlišných forem dvoudimenzionální plynové chromatografie. Hlavním cílem těchto metod bylo a je zvýšení separační schopnosti pro složité chemické vzorky.
Heart-cutting dvoudimenzionální plynová chromatografie (GC-GC) se vyznačuje tím, že pouze vybrané části efluentu z první kolony jsou nadávkovány na druhou kolonu. Cílem je vylepšit separaci cílových sloučenin, které nebyly rozděleny na první koloně. Tato technika vyžaduje dva detektory a speciální zařízení mezi dvěma sériově zapojenými kolonami. Toto zařízení slouží jako přepínací mechanismus, takže efluent z primární kolony je posílán buď přímo do detektoru, nebo do druhé kolony k další separaci. Spínací mechanismy lze rozdělit na (1) mechanický ventilový spínač nebo (2) pneumatický průtokový spínač. Posledně jmenovaný je používán častěji v komerčních GC-GC systémech (např. multi-Deans switching technology od firmy Shimadzu) a to především kvůli jeho většímu maximálnímu teplotnímu limitu (jež je dán maximální teplotou kapilárních kolon, a ne tímto zařízením). Po získání retenční informace z jednorozměrného experimentu, GC-GC metoda je následně vyvinuta tak, že pouze vybrané části (neoddělený analyt z primární kolony) jsou odkloněny do druhé kolony (heart-cuts). Sekundární kolona má rozměry podobné rozměrům primární kolony, ale polarita a selektivita obou kolon jsou odlišné. Vzorkované oblasti musí mít krátké trvání (1–10 s), jinak se budou překrývat na sekundárním koloně. Celková kapacita píků (nc) se rovná součtu kapacity primární kolony (nc1) a kapacity sekundární kolony (nc2) vynásobené počtem řezů (x).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Vzorec_3_74_0d9e870c39/2-THETA-Vzorec-3.74.jpg" alt="2 THETA: Vzorec"/>
Komprehensivní dvoudimenzionální plynová chromatografie (GC×GC) se vyznačuje tím, že celý vzorek je separován jak na první, tak na druhé koloně (Obr. 3.16). Většinou je každá kolona umístěna ve své peci, kterou lze separátně ovládat. Obecně, GC×GC vyžaduje pouze jeden detektor. V některých aplikacích však může být efluent rozdělen do více než jednoho detektoru s využitím různých výhod detektorů. Kolony (s různou selektivitou) jsou obvykle spojeny do série a rozhraní mezi nimi se nazývá modulátor. Modulátor je klíčovou součástí systémů GC×GC. Jeho funkcí je zachytit, pozdržet, a uvolnit efluent z primární do sekundární kolony v rychlých, opakujících se (modulačních) periodách. Separace na sekundární koloně musí být dokončena před dalším nástřikem. Právě proto je separace na druhé koloně extrémně rychlá, typicky trvá několik sekund ve srovnání s ~45-120 minut dlouhou separací primární kolony. Sekundární kolony jsou tedy mnohem kratší než primární (např. 2 m oproti 30 m). Rychlé separace lze navíc dosáhnout použitím sekundárních kolon s menším vnitřním průměrem (např. 0,15 mm oproti 0,25 mm). Modulátory pro GC×GC se od roku 1991 neustále zdokonalují. Komerční modulátory lze na základě jejich principu rozdělit na (1) tepelné (např. Quadjet od firmy LECO Corporation) a (2) průtokové (capillary-flow technology od firmy Agilent). Stručně řečeno, tepelné modulátory (tepelné, kryogenní a jet-pulsed) využívají teplotní rozdíl k zachycení a uvolnění efluentu ve vysokofrekvenčních periodách. Naproti tomu průtokové modulátory používají vysokorychlostní ventily k řízení průtoku v oblasti mezi primární a sekundární kolonou. Celková kapacita píků (nc) se (v ideálním případě) rovná kapacitě primární kolony (nc1) vynásobené kapacitou sekundární kolony (nc2.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Vzorec_ceaf07eed5/2-THETA-Vzorec.jpg" alt="2 THETA: Vzorec"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_3_17_Schema_GC_GC_chromatografu_79100c851e/2-THETA-Obr.-3.17-Schema-GC-GC-chromatografu.jpg" alt="2 THETA: Obr. 3.17 Schéma GC×GC chromatografu"/>
Kolony ve dvoudimenzionální plynové chromatografii bývají primárně kapilární. I ve 2D-GC hraje selektivita kapilárních kolon důležitou roli, jelikož retence sloučenin závisí na jejich interakcích se stacionární fází. Aby bylo dosaženo nejlepší možné separace, je třeba zajistit ortogonalitu výběrem kolon s různou polaritou. Vzhledem k povaze stacionárních fází je pro vytvoření ortogonálních separačních podmínek nutné použít analytické kolony, které poskytují nezávislé separační mechanismy v první a druhé dimenzi. Když jsou dvě kapilární kolony zapojeny do série tak, že první kolona je nepolární a druhá polární, označuje se tato kombinace jako normální fáze (uspořádání). Naproti tomu u kombinace první polární kolony a druhé nepolární hovoříme o tzv. reverzním uspořádání. V GC×GC mají primární kolony vyšší vliv na separaci než sekundární kolony kvůli své délce. Tudíž v normální fázi je pořadí eluce na primární koloně (osa x) řízeno body varu sloučenin (tj. lehčí sloučeniny se eluují před těmi těžšími). Sloučeniny s podobnými body varu se tak budou eluovat současně z primární kolony. Tyto sloučeniny jsou později separovány na sekundární koloně na základě jejich polarity. Pořadí eluce na sekundární koloně (osa y) se zvyšuje se zvyšující se polaritou sloučenin. V reverzní fází se retenční časy sloučenin na ose x zvyšují s jejich rostoucí polaritou. A tak méně polární sloučeniny eluují dříve než ty polárnější. Ačkoli je primární kolona polární (nebo středně polární), vliv zvyšující se teploty během běhu GC významně ovlivňuje eluci.
Detektory – Píky z GC×GC jsou velice úzké (100 - 500 ms) a tak je výběr detektoru velice důležitý. Pro správnou detekci jsou nutné detektory s nízkým vnitřním objemem, rychlým náběhem, a vysokou skenovací frekvencí (20–200 Hz). Detektory jako jsou FID, uECD, NPD, NCD, a SCD tento požadavek splňují. Hmotnostní spektrometry jsou typicky používány pro kvalitativní analýzu komplexních vzorků. TOF je nejpoužívanějším hmotnostním detektorem pro GC×GC analýzy, a to především díky jeho velmi vysoké frekvenci získávání spekter (rychlosti skenování), která může být až 500 Hz, a velkému hmotnostnímu rozlišení. Další využívanou možností je Q-TOF. I tento detektor sbírá plná spektra s dostatečnou rychlostí nezávislou na hmotnostním rozsahu. V neposlední řadě jsou to kvadrupólové analyzátory, u kterých je ale třeba vzít v potaz jeho skenovací rychlost (~50 Hz). Jelikož z GC×GC získáváme sérii po sobě jdoucích chromatogramů z druhé dimenze jež je potřeba složit do tzv. contour plotu, výběr dobrého software je velice důležitý. GC×GC software provádí primární zpracování dat, jejich vizualizaci, prohledávání, identifikaci, kvantifikaci, popř. statistickou analýzu. Jako příklad lze uvést ChromaTOF od společnosti LECO nebo GC Image od stejnojmenné společnosti.

Organická analýza - Techniky plynové chromatografie 

<h5>4.5 Využití SFC v současné praxi</h5>
<h5>4.6 Další využití SFC</h5>
<ul>
<li>4.6.1 Využití SFC k izolaci analytů - preparativní SFC</li>
<li>4.6.2 Využití SFC pro měření distribučních konstant v systému scCO₂ – IL</li>
</ul>
<h5>4.7 Závěr</h5>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Využití SFC v současné praxi</h3>
Vzhledem k tomu, že <a href="https://lcms.cz/article/3472">SFC (Superkritická Fluidní Chromatografie)</a> je poměrně novou technikou, mnoho publikovaných prací se stále věnuje fundamentálním otázkám. Významnou oblastní SFC analýz jsou však také chirální separace. SFC je mnohonásobně úspěšnější ve schopnosti rozlišovat enantiomery než LC či elektroforéza, a to i přesto, že přesný mechanismus těchto chirálních separací zatím nebyl detailně objasněn [17]. Nízká robustnost a opakovatelnost SFC separací dlouho bránila rutinními používání SFC techniky v regulovaném prostředí, např. v laboratořích kontroly kvality v rámci farmaceutického průmyslu a dalších [30]. To se změnilo v roce 2012 představením moderní SFC instrumentace a počet SFC metod v tomto oboru každý rok roste. V roce 2020 byla navíc provedena první mezilaboratorní studie zkoumající přenositelnost SFC metody pro stanovení nečistot salbutamolu mezi laboratořemi [51], která prokázala srovnatelné výsledky reprodukovatelnosti u této SFC metody jako v případě zavedené LC metody.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Rozdeleni_publikovanych_SFC_metod_ac2ad5341c/2-THETA-Rozdeleni-publikovanych-SFC-metod.jpg" alt="2 THETA: Obr. Rozdělení publikovaných SFC metod (1962 – 2021) dle jednotlivých aplikačních odvětví. Převzato ze zdroje [2] a aktualizováno."/>
Mezi první aplikační obory SFC techniky po jejím představení patřila především analýza nepolárních sloučenin, jako jsou oleje, surfaktanty, polymery, vosky a tuky, za použití čistého CO₂ a gradientu tlaku [2]. Díky zavedení organického modifikátoru do mobilní fáze a představení robustní instrumentace se však v dnešní době SFC úspěšně používá v mnoha dalších odvětvích včetně farmaceutické analýzy, bioanalýzy a analýzy potravin. Vzhledem k tomu, že je možno prakticky neomezeně kombinovat CO₂, organický modifikátor a široké spektrum stacionárních fází, je SFC schopná analyzovat tytéž směsi jako HPLC na reverzních fázích, HPLC na normálních fázích, HILIC a částečně také iontově-párová a iontově-výměnná chromatografie. Aplikovatelnost SFC samozřejmě klesá s rostoucí polaritou analyzovaných látek a analýza proteinů v SFC zůstává prozatím problematická.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Vhodnost_jednotlivych_chromatografickych_metod_pro_analyzu_latek_bdc0b2f76f/2-THETA-Vhodnost-jednotlivych-chromatografickych-metod-pro-analyzu-latek.jpg" alt="2 THETA: Obr. Vhodnost jednotlivých chromatografických metod pro analýzu látek v závislosti na jejich rostoucí polaritě. Převzato ze zdroje [3]."/>
Analýza polárních a ionizovatelných látek jako jsou polární léčiva, metabolity a aminokyseliny může být v SFC problematická. K těmto separacím se většinou využívá gradientová eluce s více něž 40 % organického modifikátoru s polárním aditivem. SFC-MS byla úspěšně použita pro dopingovou analýzu [18], kdy byla zajištěna vysoká prostupnost vzorků a citlivá detekce stovek analytů během 6 minut. Byly publikovány taktéž SFC-MS separace metabolitů ketaminu a 60 dalších polárních metabolitů v moči. Úspěšnou SFC-MS separaci polárních aminokyselin publikovala Wolrab a kol. [52]. Možnost separovat v rámci jedné SFC analýzy látky s rozdílnou polaritou pak dokazuje Obr. 4.17. Zde byla pomocí SFC v rámci 5 minut úspěšně separována směs lipofilních a hydrofilních vitamínů [53].
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_UHPSFC_MS_separace_17_vitaminu_79283b8828/2-THETA-Obr-UHPSFC-MS-separace-17-vitaminu.jpg" alt="2 THETA: Obr. UHPSFC-MS separace 17 vitamínů. (1) retinol acetát, (2) retinol palmitát, (3) D2, (4) α-tokoferol, (5) K2, (6) K1, (7) α-tokoferol acetát, (8) β-karoten, (9) nikotinamid, (10) kyselina nikotinová, (11) pyridoxin, (12) kyselina d-pantothenová, (13) biotin, (14) thiamin, (15) riboflavin, (16) B12, (17) C. Podmínky: kolona ACQUITY UPC2 HSS C18SB (50 × 3.0 mm, 2 μm), organický modifikátor: methanol/voda (95/5) s 0.2% mravenčanu amonného, několika kroková gradientová eluce z 2 do 100 % organického modifikátoru v CO2, průtok 1.2 ml/min, teplota 40°C, tlakový gradient z 15.2 MPa na 10.3 MPa [53]."/>
Ve spojení s citlivou MS detekcí jsou SFC metody úspěšně používány také v monitorování lékových hladin, environmentální analýze, analýze potravin a rostlinných extraktů, forenzní analýze a především analýze lipidů a dalších lipofilních sloučenin. V porovnání s ostatními chromatografickými metodami, SFC-MS poskytuje vysoké rozlišení a citlivost při analýze nepolárních lipidů a metabolitů. Další výhodou bývá také kratší příprava vzorků před SFC-MS analýzou, jelikož není nutné upravený vzorek převádět do polárního rozpouštědla. Toho bylo využito také v případě SFC-MS metody pro analýzu 8 forem vitamínu E v lidském séru, kdy pro přípravu vzorku byla využita proteinová precipitace následovaná extrakcí z kapaliny do kapaliny. Separace těchto 8 tokoferolů a tokotrienolů pak bylo dosaženo v rámci 2.5 min s přímým nástřikem hexan/dichlormethanového extraktu (Obr. 4.18) [54]. Ukázka SFC-MS separace tříd lipidů je uvedena na Obr. 4.19 [55].
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_UHPSFC_MS_separace_8_forem_vitaminu_E_a72e7ddde5/2-THETA-Obr-UHPSFC-MS-separace-8-forem-vitaminu-E.jpg" alt="2 THETA: Obr. UHPSFC-MS separace 8 forem vitamínu E. Isokratická eluce s CO₂ a 5 % organického modifikátoru, tj. 10
mmol/l mravenčan amonný v methanolu, průtok 1,5 ml/min, 50°C, 13.0 MPa [54]."/>
SFC je zvláště atraktivní pro analýzu tepelně labilních látek, kde při použití GC (HighTemperature GC) dochází k pyrolytickému znehodnocení analytů. Příkladem může být SFC analýza materiálu historických pečetí z doby Rudolfa II. GC analýza vyžaduje pro zplynění a pro eluci vzorku teploty, při kterých již dochází k nežádoucímu rozkladu vzorku.
<h3>Další využití SFC</h3>
<h4>Využití SFC k izolaci analytů - preparativní SFC</h4>
Kromě využití nadkritického CO₂ k separacím, kdy je cílem co nejlépe a nejrychleji separovat složité směsi látek, často pouze ve stopových koncentracích, nabývá na významu i využití SFC k izolaci většího množství látek - preparativní SFC. Kolona je v tomto případě mnohem více zatížena a volí se takové podmínky, aby byly co nejrychleji separovány cílové látky, které jsou následně odděleny do jednotlivých frakcí.
Volba nadkritické mobilní fáze přináší (v porovnání s kapalinovou preparativní chromatografií) některé specifické výhody:
<ol>
<li>Dosažitelná rychlost separací je typicky 3-5 krát vyšší oproti HPLC.
</li>
<li>Analyty jsou získány ve vysoké koncentraci. Při použití nemodifikovaného CO₂ jsou získány přímo čisté látky díky snadnému odpaření CO₂, pokud je použit modifikátor tak jsou získány vysoce koncentrované roztoky nebo suspenze.
</li>
<li>Šetrná k životnímu prostředí. Spotřeba organických rozpouštědel je redukována pouze na modifikaci CO₂ (typicky v rozsahu 5-20%). Mobilní fází je CO₂, který je levný, netoxický a šetrný k životnímu prostředí. Po chromatografické separaci na koloně dochází k oddělení mobilní fáze od analytů a CO₂ je recyklován, takže jeho spotřeba je minimalizována.
</li>
</ol>
Schéma zařízení pro preparativní SFC je vyobrazeno a specifikováno v knize <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>. Skládá se z čerpadel pro nadkritický CO₂ a modifikátor, které jsou poté míchány ve zvoleném poměru.
<h4>Využití SFC pro měření distribučních konstant v systému scCO₂ – IL</h4>
Kromě analytického využití je zajímavou aplikací SFC i její použití k získání fyzikálně chemických dat. Tato technika má již poměrně dlouhou historii v GC, kde lze takto měřit např. distribuční konstanty, G°, body varu, průběh adsorpční izotermy a povrch adsorbentu. [24] V souvislosti s rostoucím zájmem o termodynamické údaje v systémech s iontovými kapalinami (IL) je SFC velmi vhodná a rychlá metoda pro měření rozdělovacích koeficientů.
Iontové kapaliny (např. [bmim][PF₆] na Obr. 4.24) jsou organické soli, za normálních teplot kapalné, s vysokým bodem rozkladu (cca 300 °C a výše) a prakticky neměřitelnou tenzí par.
Díky této vlastnosti se záhy staly předmětem zájmu organických chemiků, neboť mohou sloužit jako reakční média a rozpouštědla pro syntézy a extrakce, která jsou šetrná k životnímu prostředí. Po syntéze či extrakci do IL lze k její recyklaci použit nadkritický CO₂, u kterého lze „ladit“ vnějšími podmínkami (tlak, teplota) jeho rozpouštěcí schopnosti a tím dosáhnout selektivní extrakce.
Pro měření rozdělovacích koeficientů je třeba připravit otevřenou kapilární kolonu se stacionární fází z IL. Náplňové kolony nejsou vhodné pro značný tlakový spád, který vnáší do měření chybu a pro významnou sorpci polárnějších analytů na aktivních centrech nosiče, takže hrozí, že změřená retence neodráží pouze distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.
Pro měření je třeba znát přesné množství stacionární fáze v systému – prakticky jediný způsob přípravy kolony je statické smáčení.
<h3>Závěr</h3>
SFC prošla v posledních 10 letech zásadním vývojem. Přestože byla původně využívána mobilní fáze v čistě nadkritickém stavu, moderní pojetí SFC běžně používá binární mobilní fázi, která je ve stavu spíše subkritickém. Výhodné chromatografické vlastnosti jsou zde přesto zachovány, jelikož hlavní složkou mobilní fáze zůstává CO₂, jež má vysokou difuzivitu a nízkou viskozitu i bod kritickým bodem. Použití mobilní fáze se zvýšenou difuzivitou se obecně projeví zkrácením doby analýz. Nižší viskozita mobilní fáze dovoluje separovat při nižších tlacích a používat náplňové kolony plněné sorbenty s menší zrnitostí, které poskytnou lepší separaci. Mezi výhody SFC patří vysoká rychlost analýz, vysoká separační účinnost, originální selektivita, a také větší šetrnost k životnímu prostředí. Moderní přístroje pro preparativní SFC navíc umožňují použitý CO₂ efektivně recyklovat.
Těžiště současných SFC aplikací leží především v separacích lipofilních látek, farmaceutických aplikacích a v preparativní SFC. Nezanedbatelná úspora času a v některých případech až řádová úspora organických rozpouštědel z ní dělá jasného favorita pro farmaceutický průmysl. Mezi aplikační odvětví SFC dále patří především chirální separace a analýza lipofilních látek jako jsou například lipidy, lipofilní vitamíny, karotenoidy a další. Použitím organického modifikátoru, případně aditiv, se však SFC úspěšně rozšířila také do dopingové analýzy, analýzy potravin, bioanalýzy a mnoha dalších.
Své místo má SFC také v dělení směsí, které vyžadují vysoké teploty pro eluci v GC a hrozí riziko rozkladu analytů. SFC-FID je vhodná pro látky, které postrádají chromoforní skupiny a jsou obtížně detekovatelné v HPLC. Tato letitá výhoda však díky ceně a dostupnosti MS detektorů pomalu ustupuje do pozadí.

 Organická analýza - Využití Superkritické Fluidní Chromatografie

<h4>5 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)</h4>
<h5>5.1 Princip kapalinové chromatografie</h5>
<h5>5.2 Nízko- a vysokotlaké techniky, analytická a preparativní LC</h5>
<h5>5.3 Termodynamický a kinetický aspekt chromatografie, chromatografická data</h5>
<h5>5.4 Kolony v HPLC</h5>
<ul>
<li>5.4.1 Tok mobilní fáze kolonou, náplně kolon pro HPLC - pórovité, povrchově pórovité, monolitické</li>
<li>5.4.2 Stacionární fáze</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Princip kapalinové chromatografie</h3>
Chromatografická separace probíhá v chromatografickém loži (kolona, papír, tenká vrstva), což je systém dvou fází, z nichž jedna je v klidu (fáze stacionární) a druhá se vůči ní pohybuje (fáze mobilní), spolu se složkami vzorku. Podle geometrie chromatografického lože rozeznáváme sloupcovou (kolonovou) kapalinovou a plynovou chromatografii a kapalinovou chromatografii v plošném uspořádání (planární) - na papíru nebo na tenké vrstvě adsorbentu.
Ideální chromatografický proces lze charakterizovat rovnovážným rozdělením složek vzorku mezi stacionární a mobilní fází v jakémkoliv čase a na jakémkoliv místě v chromatografickém loži. Tato rovnováha se neustále porušuje a okamžitě opět obnovuje, jak čerstvá mobilní fáze přichází do styku se vzorkem zadržovaným ve stacionární fázi. 
Obr. 5.1 znázorňuje postup separace dvou látek při průchodu chromatografickým ložem.
<ul>
<li>Na obr. 5.1a je stav při zavedení vzorku do chromatografického lože.</li>
<li>Obr. 5.1b ukazuje začátek separace, kdy se látka s větší afinitou ke stacionární fázi (trojúhelníčky) na ní silněji zadržuje.</li>
<li>Na obr. 5.1c se postupně oddělují zóny s jednotlivými složkami vzorku, které se pohybují chromatografickým ložem, každá vlastní rychlostí, ui, menší, než je postupná rychlost toku mobilní fáze, u. Méně zadržované látky (znázorněné kroužky) procházejí chromatografickým ložem rychleji než látky s větší afinitou ke stacionární fázi (trojúhelníčky) které se více zadržují.</li>
<li>Obr. 5.1d ukazuje stav po mnohonásobné opakované sorpci a zpětném uvolnění látek do mobilní fáze, kdy se složky vzorku úplně rozdělí.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_separace_vzorku_pri_pruchodu_chromatografickym_lozem_3d227dfd4a/2-THETA-Obr-Schema-separace-vzorku-pri-pruchodu-chromatografickym-lozem..jpg" alt="2 THETA: Obr. 5.1 Schéma separace vzorku při průchodu chromatografickým ložem..jpg"/>
Základem chromatografické separace jsou tedy rozdíly v afinitě složek vzorku ke stacionární fázi, které lze popsat distribuční konstantou, KD. Po ukončení separace se buď vyhodnotí vzájemná poloha zón vzorku v chromatografickém loži dosažená v předem určeném čase (prostorové rozlišení při chromatografii na papíru nebo na tenké vrstvě), nebo se měří čas, kdy jednotlivé zóny dosáhnou konce chromatografického lože (časové rozlišení na separační koloně).
Hlavním rozlišovacím kritériem chromatografických metod je skupenství mobilní fáze - u plynové chromatografie (gas chromatography, GC) je to nosný plyn, kapalinová chromatografie (liquid chromatography, LC) používá kapalnou mobilní fázi, zatímco stacionární fáze je zpravidla tuhá. Kapalné stacionární fáze zakotvené na nosiči nejsou dostatečně stabilní a v současné kapalinové chromatografii se nepoužívají. Výjimkou jsou dynamicky generované stacionární fáze, které se tvoří při ustavování rovnováhy mezi vícesložkovou mobilní fází a kapalnou vrstvou odlišného složení sorbovanou na povrchu adsorbentu (např. při HILIC chromatografii).
Na rozdíl od plynové chromatografie vzorky pro kapalinovou chromatografii nemusí být tepelně stálé a mít velkou tenzi par. Kapalinová chromatografie umožňuje pestřejší volbu separačních systémů s různými kombinacemi stacionárních a mobilních fází a dá se téměř univerzálně použít pro separace nejrůznějších typů látek, včetně silně polárních nebo i iontových a vysokomolekulárních přírodních či syntetických polymerů, při klinických a biochemických analýzách, analýzách léčiv a metabolitů, životního prostředí soudních analýzách a v mnoha dalších oblastech [1]. 
<h3>Nízko- a vysokotlaké techniky, analytická a preparativní LC</h3>
Při klasické sloupcové kapalinové chromatografii se používají skleněné kolony válcového tvaru, na dně opatřené fritou a kohoutem, plněné za sucha sorbenty s částicemi &gt; 20 μm. Mobilní fáze (eluent) většinou protéká kolonou vlivem hydraulické síly z dělící nálevky. Eluent se separovanými složkami vzorku se postupně odebírá ve frakcích na výstupu z kolony pro další analýzu chemickou nebo instrumentální (zpravidla fotometrickou) metodou.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Sklenena_kolona_s_nalevkou_fritou_a_vystupnim_kohoutem_pro_nizkotlakou_LC_77efa51c09/2-THETA-Obr.-Sklenena-kolona-s-nalevkou-fritou-a-vystupnim-kohoutem-pro-nizkotlakou-LC.jpg" alt="2 THETA: Obr. Skleněná kolona s nálevkou, fritou a výstupním kohoutem pro nízkotlakou LC"/>
Moderní analytická vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) pracuje v kontinuálním uspořádání, téměř výhradně eluční technikou, kde čerpadlo dávkuje mobilní fázi při stálém průtoku kolonou, 2 - 30 cm dlouhou, s vnitřním průměrem 0,1 - 6 mm, plněnou sorbentem s jemnými částicemi s úzkou distribucí velikostí (se středním průměrem 2,5 - 10 μm), na nichž se dosahuje vysoké účinnosti (až 100 000 teoretických pater/m). 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_kapalinoveho_chromatografu_01179389e9/2-THETA-Obr.-Schema-kapalinoveho-chromatografu.jpg" alt="2 THETA: Obr. Schéma kapalinového chromatografu. 1 - zásobník mobilní fáze, 2 - vysokotlaké čerpadlo, 3 - průtočný odplyňovač mobilní fáze, 4 - separační kolona, 5 - detektor, 6 - termostat kolony, 7 - dávkovač vzorků (autosampler), 8 - počítač s chromatographickou datovou stanicí"/>
Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) a ultraúčinná kapalinová chromatografie (Ultra-Performance Liquid Chromatography, UPLC) používá náplně kolon s částicemi menšími než 2 μm při velmi vysokém pracovním tlaku až 100-150 MPa (1000 - 1500 bar) [3]. Podobně u chromatografie na tenké vrstvě rozeznáváme klasickou TLC (Thin Layer Chromatography) a vysokoúčinnou techniku, HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) či přetlakovanou techniku, OPTLC (Overpressurized Thin Layer Chromatography).
<h3>Termodynamický a kinetický aspekt chromatografie, chromatografická data</h3>
Chromatografická separace je založena na rozdílech v distribuci jednotlivých složek vzorku mezi stacionární a mobilní fází. Při sloupcové chromatografii složky vzorku vystupují z kolony v různém čase. Chromatogram představuje časový záznam signálu detektoru se vzájemně oddělenými elučními vlnami (píky) jednotlivých látek. Při malém zatížení kolony vzorkem při lineární chromatografii mají píky (téměř) symetrický Gaussovský profil.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Idealni_chromatogram_dvouslozkove_smesi_03c0a8e6d9/2-THETA-Obr.-Idealni-chromatogram-dvouslozkove-smesi.jpg" alt="2 THETA: Obr. Ideální chromatogram dvousložkové směsi.jpg"/>
Složky vzorku lze identifikovat na základě shody jejich elučních (retenčních) časů s retenčními časy standardů. Z výšek nebo ploch píků je možno stanovit obsah složek ve vzorku.
<h3>Kolony v HPLC</h3>
Dobrá chromatografická kolona musí být chemicky odolná vůči mobilní fázi a pracovnímu tlaku. Kolony pro HPLC obsahují chromatografické lože ve formě částic sorbentu nebo nosiče se stacionární fází v rovných bezešvých trubicích s leštěným vnitřním povrchem, z nerezové oceli, titanu, případně z pevného plastu (např. PEEK), nebo z tvrzeného skla (pro separace biopolymerů, kde je třeba zabránit katalytickým účinkům i stop kovů v mobilní fázi). Účinné a stabilní kolony pro HPLC se připravují plněním suspenzí částic náplně v kapalině s vysokou viskozitou nebo hustotou za vysokého tlaku, aby se zabránilo zhoršení účinnosti vlivem shlukování a sedimentace částic.
Kolony se dodávají buď s pevným koncovým šroubením, nebo jako výměnné kartridže pro upevnění v držácích s koncovkami pro opakované použití. Jsou na koncích opatřené fritami s póry 0,5 - 2 μm. Spodní frita zadržuje částice náplně, horní frita napomáhá pravidelnému rozdělení vzorku v průřezu kolony. Spojovací kapiláry mezi dávkovačem vzorku, kolonou a detektorem by měly být co nejkratší a měly by mít co nejmenší vnitřní průměr, aby se omezily mimokolonové příspěvky k rozšiřování píků.
<h4>Tok mobilní fáze kolonou, náplně kolon pro HPLC - pórovité, povrchově pórovité, monolitické</h4>
Částice náplní kolon pro HPLC musí být mechanicky i chemicky stabilní, odolávat používaným pracovním tlakům a mobilním fázím v co nejširším rozsahu teplot, měly by vykazovat vysokou chromatografickou účinnost (nízký výškový ekvivalent teoretického patra, H) a klást malý odpor toku mobilní fáze (mít dobrou permeabilitu, KF, která je přímo úměrná druhé mocnině střední velikosti částic náplně, d²p). Moderní částice náplní pro HPLC mají kulový tvar a jsou pečlivě tříděny na frakce s velmi úzkou distribucí velikosti částic. 
Pórovitost materiálů pro HPLC kolony závisí na velikosti molekul separovaných látek. Pro separace běžných organických látek jsou vhodné částice s velikostí pórů 5 - 10 nm a specifickým povrchem 150 - 500 m²/g, zatímco pro separace polymerů se používají částice se širokými póry, 15 - 100 nm, a menším specifickým povrchem, zpravidla 10 - 150 m²/g. Ve větším objemu pórů mají makromolekuly snadnější přístup ke stacionární fázi uvnitř pórů vlivem menšího odporu proti převodu hmoty, čímž se zlepšuje účinnost separace. Pro velmi rychlé dělení biopolymerů byly vyvinuty náplně s nepórovitými sférickými částicemi o průměru 1,5 - 2,5 μm.
Podobné vlastnosti, ale mnohem menší odpor proti toku mobilní fáze mají kolony plněné povrchově pórovitými sférickými částicemi (2,6, nověji i 5 nebo &lt; 2μm) s inertním pevným jádrem (core-shell), na němž je tenká vrstva pórovité aktivní stacionární fáze o tloušťce 0,5 m nebo i méně. Podstatně kratší dráha k povrchu stacionární fáze než u pórovitých náplní kolon možňuje dosažení rychlých a účinných separací, téměř srovnatelných s technikou UHPLC, ale na běžných přístrojích pro konvenční HPLC [10].
<h4>Stacionární fáze</h4>
Pro přípravu stacionárních fází pro HPLC se v současné době nejčastěji používá vysoce čistý silikagel typu sol-gel, mechanicky velmi stabilní, prakticky bez stopových příměsí kovů, které mohou nežádoucím způsobem katalyticky působit na složky vzorku. 
Na povrchu silikagelu je rozmístěno cca 8-9 μmol/m² polárních hydroxylových skupin (silanoly, Si-OH), jejichž hustota roste úměrně se specifickým povrchem. Nemodifikovaný silikagel lze použít jako polární adsorbent v systémech s normálními fázemi, buď v čistě organických mobilních fázích (adsorpční chromatografie), nebo v polárních organických rozpouštědlech s menším obsahem vody (chromatografie hydrofilních interakcí, HILIC). Častěji silikagel slouží jako nosič chemicky vázaných nepolárních, polárních nebo i iontových stacionárních fází, které se naváží na jeho povrch, většinou prostřednictvím kovalentní Si–O–Si–C– vazby reakcemi se silanizačními činidly, např. s alkyldimethylchlorsilany [13] (Obr. 5.8). Dynamické vlastnosti těchto náplní (účinnost a permeabilita kolony) jsou určovány především vlastnostmi nosiče (silikagelu), tedy jeho strukturou a velikostí částic, zatímco termodynamické chování (retence a selektivita chromatografovaných látek) jsou dány chemicky vázanou fází [14].

Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 1/4

<h4>7. SPOJENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH TECHNIK A HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE</h4>
<h5>7.1 Spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS)</h5>
<h5>7.2 Instrumentace pro GC/MS</h5>
<ul>
<li>7.2.1 GC/MS s kvadrupólem</li>
<li>7.2.2 GC/MS se sférickou iontovou pastí</li>
<li>7.2.3 GC/MS s trojitým kvadrupólem</li>
<li>7.2.4 GC/MS se sektorovými analyzátory</li>
<li>7.2.5 GC/MS s analyzátorem doby letu</li>
<li>7.2.6 GC/MS s Orbitrapem</li>
<li>7.2.7 GC/FT-ICR MS</li>
<li>7.2.8 GC/Q-TOF</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie</h3>
Spojení separačních technik s hmotnostní spektrometrií dnes představuje velmi významnou a velmi účinnou analytickou techniku pro charakterizaci organických látek, nacházejících se i v komplikovaných směsích ve velmi rozdílných koncentracích. Toto spojení úspěšně eliminuje slabinu chromatografických technik, kterou je spolehlivost identifikace založená na porovnání retenčního chování neznámé látky (nejčastěji retenčního času) v analyzovaném vzorku se standardem. Zde je ale jedinou jistotou konstatování, že pokud se retenční chování liší, nejsou standard a neznámá složka látky totožné. Pokud je však „v dobré shodě“, může se (ale nemusí) jednat o stejnou sloučeninu. Jistota konstatování o shodě samozřejmě závisí na konkrétních podmínkách separace (např. účinnost kolony – u kapilárních kolon v GC je daleko vyšší než u HPLC); lze ji výrazně zvýšit při ověření retenčního chování v druhém systému s odlišným mechanismem separace. Naproti tomu analýza směsi organických sloučenin pomocí hmotnostní spektrometrie s elektronovou ionizací zpravidla nevede k smysluplnému výsledku, neboť je zhusta nemožné přiřadit fragmenty příslušné složce směsi (pokud nebereme v úvahu několik výjimek jako například strukturně typová analýza ropy). Mimořádně malé nároky na množství vzorku u hmotnostní spektrometrie pak dovolují sejmout dostatečně kvalitní spektra i z takových množství sloučenin, která nepřetíží chromatografické kolony.
<h3>Spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS)</h3>
Potenciál využití hmotnostní spektrometrie jako detekční metody u plynové chromatografie byl rozpoznán velice brzy. Plynová chromatografie jako analytická technika spatřila světlo světa v roce 1952, kdy byla popsána rozdělovací plynová chromatografie (Gas-Liquid Chromatography, GLC) [1], adsorpční plynová chromatografie (Gas-Solid Chromatography, GSC) pak byla objevena o rok později [2]. A již v roce 1956 byly provedeny první experimenty se spojením plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií [3], a tato technika byla pak velmi rychle rozvíjena [4] a využita v analytické praxi – např. [5-9].
Hmotnostní spektrometr jako detektor u plynové chromatografie (ale i u kapalinové chromatografie, superkritické fluidní chromatografie a elektromigračních technik) může obecně pracovat v následujících režimech:
SCAN – hmotnostní spektrometr skenuje (snímá kompletní hmotnostní spektra) v nastaveném rozsahu s nastavenou frekvencí. Tento mód je obecně využíván při analýze neznámých směsí látek a zpravidla neumožňuje dosažení výrazně nízkých mezí detekce.
SIM (Selected Ion Monitoring) – hmotnostní spektrometr sleduje pouze vybraný ion (je pevně nastaven na zvolenou hodnotu m/z). Tento mód je vhodný pro cílenou analýzu jedné vybrané sloučeniny na stopové hladině.
MID (Multiple Ion Detection) – hmotnostní spektrometr sleduje několik zvolených hodnot m/z. Stejně jako přechozí je vhodný pro cílenou analýzu vybraných sloučenin s tím, že se zvyšujícím se počtem sledovaných iontů se zhoršují meze detekce.
Při využití tandemové hmotnostně spektrometrické detekce lze využít čtyř základních režimů:
Sken produktů (Product Scan): první analyzátor vybírá zvolený prekurzor, který je v druhém kvadrupólu kolizně aktivován a třetí kvadrupól skenuje vzniklé produktové fragmenty.
Sken prekurzorů (Precursor Scan): Třetí kvadrupól je nastavený na m/z zvoleného produktového iontu a první kvadrupól skenuje. Tímto způsobem se ke zvolenému produktu vyhledá jeho prekurzor (příp. prekurzory).
Sken konstantní neutrální ztráty (Constant Neutral Loss Scan): Skenuje první i třetí kvadrupól při zachování konstantní diference mezi nimi, která určuje sledovanou neutrální ztrátu.
Sledování vybrané fragmentace/vybraných fragmentací (Multiple Reaction Monitoring, MRM) – první i třetí kvadrupól jsou nastavené na zvolený prekurzor a produkt (případně přepínají mezi zvolenými dvojicemi); tento mód je nejvhodnější pro cílenou analýzu na stopové a ultrastopové úrovni.
<h3>Instrumentace pro GC/MS</h3>
<h4>GC/MS s kvadrupólem</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3-14">Literatura GC/MS s kvadrupólem v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
Tyto přístroje patří k nejpopulárnějším. Díky malým rozměrům kvadrupólu jsou ve stolním provedení a nezabírají příliš mnoho místa. Kvadrupól jakožto robustní a spolehlivý analyzátor nepříliš náročný na obsluhu dává těmto systémům značnou užitnou hodnotu. Tandemy tohoto typu jsou v portfoliu prakticky všech firem dodávajících GC/MS instrumentaci a pro svoji spolehlivost jsou využívány v řadě laboratoří zejména pro rutinní analýzu.
<h4>GC/MS se sférickou iontovou pastí</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3-12">Literatura GC/IT v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
Tyto systémy umožňovaly využití tandemové (a teoreticky i vícestupňové) hmotnostní spektrometrie při detekci separovaných sloučenin, což významně přispívalo k minimalizaci chemického šumu a tím ke zlepšení mezí detekce. Sférické iontové pasti byly poněkud náročnější na obsluhu a zkušenost operátora při optimalizaci příslušných parametrů.
<h4>GC/MS s trojitým kvadrupólem</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3-15">Literatura GC/QQQ v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
Trojitý kvadrupól je nejčastěji využíván v režimu tandemové hmotnostní spektrometrie. Jeho nejsilnější stránkou je cílená detekce vybraných sloučenin v režimu MRM (Multiple Reaction Monitoring) na stopové a ultrastopové úrovni.
<h4>GC/MS se sektorovými analyzátory</h4>
Systémy tohoto typu využívají analyzátorů s dvojí fokusací (většinou konfigurace EB), umožňují MS detekci s vysokým rozlišením. Ta může významným způsobem přispět k minimalizaci chemického šumu a ke zvýšení selektivity detekce.
<h4>GC/MS s analyzátorem doby letu</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3-13">Literatura GC/TOF v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
Analyzátor doby letu (TOF) byl historicky vůbec prvním analyzátorem využitým ve spojení GC/MS. Analyzátor doby letu z principu není schopen pracovat v režimu detekce vybraných iontů (SIM), neboť vždy zpracovává všechny ionty do něho vyslané. Díky tomu jsou kompletní spektra registrována s mezemi detekce porovnatelnými s režimem SIM.
<h4>GC/MS s Orbitrapem</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3-17">Literatura GC/Orbitrap v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
Tandemy tohoto typu jsou komerčně dostupné od roku 2015, když se předtím podařilo optimalizací algoritmu Fourierovy transformace a využitím elektrického pole vysoké intenzity u „kompaktního“ Orbitrapu zvýšit frekvenci skenování až na 40 Hz, což bylo dostačující i pro štíhlé píky u kapilární plynové chromatografie.
<h4>GC/FT-ICR MS</h4>
Tento tandem je poměrně exotický díky extrémně vysokému rozlišení hmotnostního spektrometru i jeho pořizovacím a provozním nákladům, a rovněž komplikovaný vzhledem k nutnosti udržení extrémně kvalitního vakua v měrné cele hmotnostního spektrometru (10-7 Pa a méně). Nevýhodou je rovněž poměrně malá frekvence registrace hmotnostních spekter (typicky cca 1 Hz).
<h4>GC/Q-TOF</h4>
<ul>
<li><a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=16-3">Literatura GC/Q-TOF v knihovně LabRulezGCMS</a></li>
</ul>
V podstatě se jedná o trojitý kvadrupól, v němž je třetího kvadrupólu použit analyzátor doby letu s orthogonální pulsní akcelerací iontů.

Organická analýza - Spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS)

<h5>5.6 Chromatografické fázové systémy</h5>
<ul>
<li>5.6.1 Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi</li>
<li>5.6.2 Chromatografie v systémech s normálními fázemi</li>
<li>5.6.3 Iontově-výměnná chromatografie, iontová chromatografie a chromatografie iontové výluky</li>
<li>5.6.4 Chromatografie prostorové výluky</li>
<li>5.6.5 Separace založené na tvorbě komplexů, chirální separace, bioafinitní chromatografie<h5>5.7 Vývoj a optimalizace pracovních podmínek při HPLC</h5>
<h5>5.8 Programované a kombinované HPLC separační techniky</h5>
</li>
<li>5.8.1 Gradientová eluce</li>
<li>5.8.2 Dvourozměrná kapalinová chromatografie<h5>5.9 Závěr</h5>
</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Chromatografické fázové systémy</h3>
Kombinaci použité stacionární a mobilní fáze označujeme jako chromatografický systém. Interakce mezi složkami vzorku, mobilní a stacionární fází určují mechanismus retence a separace jednotlivých složek vzorku. Podle převažujících interakcí můžeme rozlišit čtyři základní typy (módy) kapalinové chromatografie:
<ul>
<li>I. Chromatografie v systémech s normálními fázemi (NP LC);</li>
<li>II. Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi (RP LC);</li>
<li>III. Chromatografie iontové výměny (IE LC)</li>
<li>IV. Chromatografie prostorové výluky (gelová chromatografie, SEC)</li>
</ul>
Vedle těchto základních módů se používají i speciální techniky, např. bioafinitní chromatografie, chirální HPLC, micelární HPLC, chromatografie ligandové výměny, aj. [30].
<h5>Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi</h5>
Chromatografie v systémech s převrácenými fázemi (RP LC) je technikou první volby v současné praxi HPLC, protože se hodí pro dělení látek, které se liší velikostí hydrofobních částí molekul, např. členů homoogických nebo oligomerních řad, umožňuje ale i separace velmi pestré škály nepolárních, středně nebo silně polárních a někdy i iontových látek, lišících se počtem a charakterem alkylových či středně polárních substituentů, od aromatických uhlovodíků až po silně polární cukry či peptidy, proteiny, oligonukleotidy. Separace je založena především na nepolárních (disperzních) interakcích mezi analyzovanými látkami, mobilní i stacionární fází.
Stacionární fáze nejčastěji obsahují nepolární oktadecylové, oktylové, či jiné alkylové a alkylarylové skupiny chemicky vázané na silikagelu, případně i mírně polární, např. nitrilové skupiny.
V RP systémech se mobilní fáze skládá se většinou z vody a jednoho či více polárních rozpouštědel, nejčastěji methanolu nebo acetonitrilu. Eluci látek urychluje klesající polarita a rostoucí koncentrace organického rozpouštědla, které mohou ovlivňovat i selektivitu separace. Značně lipofilní látky, které se ve vodně-organických fázích velmi silně zadržují, např. estery mastných kyselin lze často separovat v systémech tzv. bezvodé chromatografie s převrácenými fázemi (non-aqueous reversed-phase chromatography, NARP) s mobilními fázemi, obsahujícími pouze organická rozpouštědla (např. acetonitril a dichloromethan) [30].
<h5>Chromatografie v systémech s normálními fázemi</h5>
V systémech s normálními fázemi (NP LC) se používají polární stacionární fáze, buď anorganické polární adsorbenty (nejčastěji silikagel, ale i oxid hlinitý), či polární fáze (aminové, nitrilové, diolové, nitro a další) chemicky vázané na povrchu anorganického adsorbentu. Adsorpce vzorků na aktivních polárních centrech (volné hydroxylové skupiny, aj.) roste se specifickým povrchem polárních anorganických adsorbentů. Velikost retence lze nejsnadněji ovlivnit volbou mobilní fáze, nejčastěji dvousložkové směsi organických rozpouštědel s různou polaritou (např. propanol a n-hexan), které jsou méně polární než fáze stacionární. Polární adsorpční centra se desaktivují v přítomnosti vody, která se na nich přednostně adsorbuje. Při použití vysušených rozpouštědel retence roste. Zvýšení koncentrace polárního rozpouštědla urychlí eluci. Selektivitu separace lze ovlivňovat i použitím vícesložkových organických mobilních fází.
Látky se eluují v pořadí rostoucích polarit, to znamená s rostoucím počtem a polaritou funkčních skupin v molekulách. Adsorpční chromatografie v organických mobilních fázích se používá především pro separace středně a málo polárních látek, které se liší počtem a polohou polárních funkčních skupin, zejména izomerů, které vykazují různě silné interakce s adsorpčními centry na povrchu adsorbentu [34].
Pokud se polární látky v čistě organických mobilních fázích příliš silně zadržují, lze k separaci v systémech s normálními fázemi často využít vodně-organických mobilních fází, při technice označované jako chromatografie hydrofilních interakcí (HILIC).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Struktury_vybranych_stacionarnich_fazi_pro_HILIC_chromatografii_7f6ae743c5/2-Theta-Obr-Struktury-vybranych-stacionarnich-fazi-pro-HILIC-chromatografii.jpg" alt="2 Theta: Obr. Struktury vybraných stacionárních fází pro HILIC chromatografii"/>
<h5>Iontově-výměnná chromatografie, iontová chromatografie a chromatografie iontové výluky</h5>
Iontově-výměnná chromatografie (IE LC) je starou chromatografickou technikou separace iontových látek, která je založená na elektrostatických interakcích mezi iontově-výměnnými skupinami ionexů, opačně nabitými ionty separovaných látek a tzv. protiionty v mobilní fázi. K separaci kationtů (protonovaných bazických látek) slouží silné katexy se záporně nabitými sulfonovými skupinami, nebo slabé katexy, většinou s karboxylovými skupinami. Anionty silných či slabých kyselin lze separovat na silných anexech s kvarterními amoniovými výměnnými skupinami nebo na slabých anexech s terciárními nebo sekundárními aminoskupinami, např. trimethylamoniovými nebo diethylaminoethylovými. Silné ionexy jsou ionizovány v celé oblasti pH, slabé katexy pouze v alkalické a slabé anexy pouze v kyselé oblasti [37]. Starší typy ionexů měly organickou polymerní matrici, většinou buď hydrofóbní styren-divinylbenzenový kopolymer, nebo hydrofilní - např. ethylenglykol-methakrylátový gel. Novější typy ionexů obsahují iontově-výměnné skupiny chemicky vázané na povrchu silikagelu, které jsou odolnější při vyšším pracovním tlaku, ale - jako všechny stacionární fáze na bázi silikagelu – podléhají hydrolýze při vyšším pH, které je často třeba pro úspěšnou separaci aniontů. Iontově-výměnná chromatografie je založena na Coulombických interakcích, které mají za následek stechiometrickou reakci.
Uspokojivé řešení přinesly až práce Smalla, Stevense a Baumana v polovině sedmdesátých let mibulého století, kteří popsali separaci směsi anorganických aniontů na ionexech s konduktometrickou detekcí. Autoři tuto techniku označili názvem iontová chromatografie (IC) [38]. 
Při chromatografii iontové výluky se využívá odpudivých interakcí mezi stejně nabitými ionty a iontově-výměnnými skupinami ionexu (Donnanův efekt). Na rozdíl od IEC techniky zde retence klesá s rostoucí ionizací a počtem iontových skupin ve vzorku. Techniky vysolovací chromatografie (podle analogie s vysolením organických látek při jednorázových extrakcích kapalinou) lze využít pro separace iontových látek, které se liší velikostí uhlovodíkové části molekuly na stacionárních fázích s alkyly chemicky vázanými na silikagelu.
<h5>Chromatografie prostorové výluky</h5>
Při chromatografii prostorové výluky (size-exclusion chromatography, SEC), často označované jako gelová chromatografie, se látky dělí podle rozdílů přístupnosti objemu pórů v koloně pro různě velké molekuly. Technika tedy slouží především pro separace syntetických makromolekul nebo biopolymerů. Pracuje s kolonami plněnými hydrofilními či lipofilními gely (podle polarity separovaných vzorků). Distribuce vnitřních pórů určuje velikost molekul, které mohou pronikat dovnitř, musí být proto dobře definována. V ideálním případě gely neobsahují žádné skupiny, které by mohly se vzorky aktivně interagovat a látky se eluují v pořadí klesajících molekulárních hmotností, Mr, mezi elučním objemem odpovídajícím mezičásticovému objemu mobilní fáze a celkovým objemem mobilní fáze v koloně - mezi částicemi i uvnitř pórů. SEC chromatografie se tradičně používá pro charakterizaci distribuce Mr polymerů [42].
<h5>Separace založené na tvorbě komplexů, chirální separace, bioafinitní chromatografie</h5>
V kapalinové chromatografii se občas využívá komplexotvorných rovnováh, jichž se účastní separované látky ve stacionární nebo v mobilní fázi. Po přídavku vhodného komplexotvorného činidla k mobilní fázi, např. kovových iontů nebo aniontů nižších karboxylových kyselin nebo hydroxykyselin, některé látky mohou vytvářet komplexy, které se liší retencí od volných látek. To lze využít k ovlivnění retence a selektivity separace složek vzorku. Příkladem může být např. zvýšení selektivity separace některých lipidů nebo karotenoidů a dalších látek, které se lišící počtem a polohou dvojných vazeb při argentační chromatografii, kde se využívá tvorby π-elektronových komplexů stříbrných iontů, zpravidla vyloučených na povrchu silikagelu [44]. Chromatografie ligandové výměny využívá kovových iontů (např. Cu²⁺ nebo Ni²⁺) či jejich chelátů, imobilizovaných ve stacionární fázi, nebo přidaných do mobilní fáze. Látky, které mají dvě polární skupiny v molekule vhodně prostorově rozmístěny, např. alifatické aminoalkoholy nebo aminokyseliny, vytvářejí s nimi komplexy, které se eluují v pořadí klesající stability. Tato technika se však vyznačuje nízkou separační účinností a její praktický význam je omezený [45].
Na distribuci separovaných látek mezi nepolární stacionární fázi, vodnou mobilní fází a micelární &quot;pseudofází&quot; je založena micelární kapalinová chromatografie.
Chirální separace umožňují rozlišit optické izomery (což má zvláštní význam u léčiv, kde se enantiomery mohou lišit terapeutickými i toxickými vlastnostmi). Využívá se specifických prostorových interakcí enantiomerů s chirálními činidly (selektory).
Bioafinitní chromatografie využívá biospecifických interakcí typu klíč - zámek mezi tvarově komplementárními dvojicemi antigen - protilátka, inhibitor - enzym, atp. Jedna partnerská látka je imobilizována ve stacionární fázi a slouží k selektivnímu záchytu, k obohacení a izolaci druhého partnera s komplementární strukturou.
<h3>Vývoj a optimalizace pracovních podmínek při HPLC</h3>
Při vývoji HPLC metody je třeba nastavit řadu pracovních podmínek, které ovlivňují separaci tak, aby bylo dosaženo separace všech významných složek vzorku, pokud možno v co nejkratším čase analýzy [50]. U složitých vzorků je velmi důležitý počet látek, které lze na jednom chromatogramu rozlišit, tzv. píková kapacita, která závisí na počtu teoretických pater kolony a na retenčních časech první a poslední eluované látky.
<h3>Programované a kombinované HPLC separační techniky</h3>
<h5>Gradientová eluce</h5>
Separujme-li složité vzorky při časově stálých podmínkách, t.j. izokratickou elucí, slabě zadržované látky se mohou vzájemně špatně dělit, nebo se některé složky vzorku mohou příliš silně zadržovat. Tento &quot;obecný problém eluce&quot; lze řešit programováním pracovních podmínek v průběhu separace vzorku tak, aby se retence látek v průběhu eluce snižovala. K tomu můžeme využít programu časové změny průtoku nebo teploty. Zvýšení teploty o 1-2°C často vede ke snížení retenčních faktorů malých molekul o 1 %. Mnohem účinnější je programování složení mobilní fáze při gradientové eluci.
<h5>Dvourozměrná kapalinová chromatografie</h5>
Kvalitu separace lze zlepšit i kombinací různých kolon ve dvourozměrné kapalinové chromatografii - 2D HPLC. V „off-line“ uspořádání izolujeme frakce eluátu z první kolony a po úpravě objemu dávkujeme na druhou kolonu. Při přímém &quot;in-line&quot; spojení dvou různých kolon v sérii odebíráme eluát z první kolony v malých frakcích, které přímo převádíme na druhou kolonu. Při tzv. „heart-cut“ technice (LC-LC) podrobíme analýze ve druhé dimenzi jen vybrané frakce. Při úplné comprehensive) LCxLC chromatografii postupně projdou oběma kolonami všechny složky vzorku a teoreticky je možno dosáhnout separace celkového počtu látek, který je roven násobku počtu rozdělených píků v první a druhé dimenzi
Pro dvourozměrné separace v reálném čase při přímém (on-line) spojení dvou LC systémů je nezbytné, aby separace na druhé koloně proběhla velmi rychle, během jedné minuty nebo i v kratší době, v čase, který je k dispozici pro sběr následující frakce z první dimenze ve smyčce ventilu použitého jako rozhraní mezi oběma kolonami.
<h3>Závěr</h3>
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je jedním z nejpoužívanějších a nejužitečnějších nástrojů pro řešení různých typů problémů organické analýzy. Na rozdíl od ostatních separačních technik HPLC umožňuje separace širokého spektra kapalných a tuhých vzorků látek různých polarit a molekulárních hmotností, od malých molekul (s výjimkou plynů) až po biopolymery a syntetické polymery, jak uhlovodíky, tak i polární a iontové látky. To je dáno velkým výběrem možných kombinací různých stacionárních a mobilních fází i detekčních metod, i když standardním HPLC systémem první volby, který často poskytne úspěšný výsledek, je separace na koloně s oktadecylovou fází chemicky vázanou na silikagelu, vodným acetonitrilem jako mobilní fází a spektrofotometrickým UV detektorem.

Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 3/4

<h5>5.5 Instrumentace v HPLC</h5>
<ul>
<li>5.5.1 Zásobníky, úprava a čerpání mobilní fáze</li>
<li>5.5.2 Systémy pro tvorbu gradientu mobilní fáze</li>
<li>5.5.3 Dávkování vzorků</li>
<li>5.5.4 Detektory pro HPLC</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Instrumentace v HPLC</h3>
Přístroje pro HPLC - kapalinové chromatografy se mohou sestavit z jednotlivých prvků (modulů): zásobníků a zařízení pro úpravu mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, často v úpravě pro možnost tvorby gradientu mobilní fáze, dávkovače vzorků, temperované skříně pro umístění chromatografické kolony, detektoru, poskytujícího elektrický signál při průchodu separovaných látek z kolony, zařízení pro elektronické zpracování časové závislosti elektrického signálu detektoru, vyhodnocování a zpracování chromatografických dat a grafickou prezentaci chromatogramů pomocí integrátoru či počítače. Častěji se používají kompaktní přístroje, kde jsou všechny prvky propojené, a můžeme zvolit jejich různé kombinace podle požadovaných parametrů [20-22].
<h4>Zásobníky, úprava a čerpání mobilní fáze</h4>
Zásobníky mobilní fáze tvoří zpravidla skleněné lahve o kapacitě 1 - 2,5 litrů, opatřené trubicemi pro přívod helia, na konci s fritou, která složí k rovnoměrnému rozptýlení bublinek v objemu zásobníku. Probublávání heliem, které se velmi málo rozpouští v mobilní fázi, slouží k odplynění (odstranění rozpuštěného vzduchu) z mobilní fáze, aby se zabránilo jejich uvolnění ve ventilech čerpadel a při směšování složek gradientu mobilní fáze, kde by narušovaly plynulost toku mobilní fáze a přesnost retenčních časů, a v detektoru, kde by rušily hladký záznam signálu a zhoršovaly citlivost a přesnost kvantitativní analýzy. Pro dokonalejší odplynění lze použít vakuový průtočný odplyňovač, což je polopropustná membrána ve tvaru kapilární trubice, umístěná ve vakuové komoře před vstupem na kolonu. Rozpuštěný plyn z mobilní fáze prochází stěnou membrány do prostoru se sníženým tlakem. Před vstupem do čerpadla prochází mobilní fáze průtočným filtrem (fritou s póry 0,5 - 2 μm), odstraňující případné drobné tuhé částečky.
Čerpadla mobilní fáze zabezpečují přesný bezpulzní transport mobilní fáze při pracovním tlaku až 40 MPa u konvenční HPLC, a do 100 - 150 MPa při technice UHPLC. Konstrukční materiál musí být odolný proti korozi i při použití poměrně agresivních mobilních fází (např. slabě kyselých tlumivých roztoků - nerezová ocel, titan, keramika).
V začátcích HPLC se používala jednoduchá pneumatická čerpadla, pracující při konstantním tlaku. V současné době se pro HPLC většinou používají pístová čerpadla, která pracují s konstantním objemovým průtokem mobilní fáze. Konstrukce vychází z principu injekční stříkačky, spojené se zásobníkem mobilní fáze a s vysokotlakou částí přístroje přes zpětné ventilky, které se střídavě otvírají a zavírají při střídavém pohybu pístu vpřed (výtlak) a zpětném pohybu (sání).
<h4>Systémy pro tvorbu gradientu mobilní fáze</h4>
Cílem gradientové eluce je urychlení separace a zvětšení počtu separovaných látek (píkové kapacity) v průběhu jedné separace. Podle nastaveného programu se směšují dvě nebo více složek mobilní fáze tak, aby s časem rostla koncentrace složky mobilní fáze s větší eluční sílou a urychlila se eluce silněji zadržovaných látek. Gradientové chromatografy se mohou použít i ke směšování mobilních fází, jejichž složení se v průběhu eluce nemění. V praxi se používají přístroje s tvorbou gradientu buď v nízkotlaké, nebo ve vysokotlaké části přístroje [23].
a) V nízkotlakém systému se složky mobilní fáze mísí v malé směšovací komůrce před vstupem do vysokotlakého čerpadla, přičemž poměr směšovaných složek se řídí podle časového programu, který mění poměr doby, po kterou se v krátkém pracovním cyklu střídavě otvírají a zavírají proporcionální (solenoidní) ventily na přívodním potrubí jednotlivých složek mobilní fáze (Obr. 5.10i). Přesnější je programování průtoku dvou či tří pomocných nízkotlakých mikročerpadel, dávkujících jednotlivé složky (Obr. 5.10ii).
b) Ve vysokotlakém systému dávkuje každou složku mobilní fáze vlastní vysokotlaké čerpadlo do směšovací komůrky před kolonou. Průtok každé složky se mění tak, aby celkový průtok zůstával v průběhu gradientu konstantní (Obr. 5.10iii).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Nizkotlake_i_ii_a_vysokotlake_iii_systemy_pro_gradientovou_eluci_eda02fca57/2-Theta-Obr-Nizkotlake-(i-ii)-a-vysokotlake-(iii)-systemy-pro-gradientovou-eluci..jpg" alt="2 Theta: Obr. 5.1 Nízkotlaké (i, ii) a vysokotlaké (iii) systémy pro gradientovou eluci."/>
<h4>Dávkování vzorků</h4>
Vzorky se zavádějí na kolonu kapalinového chromatografu dávkovacími ventily se smyčkou předem naplněnou vzorkem, bez přerušení toku mobilní fáze. U manuálně ovládaných ventilů se vzorek se dávkuje ručním přepnutím ventilu do druhé polohy. Plnění smyčky i přepínání poloh ventilu je u automatických dávkovačů ovládáno pneumaticky nebo elektricky a je řízeno počítačem. V nejjednodušším případě má dávkovací smyčka fixní vnitřní objem a pro dávkování jiných objemů je třeba smyčku vyměnit. Dávkovače s volitelným objemem smyčky mají složitější konstrukci, požadovaný objem vzorku se zavádí pomocí servomotorem ovládané injekční stříkačky pouze do části smyčky. 
<h4>Detektory pro HPLC</h4>
Do detektorů se zavádí eluát z chromatografické kolony. Detektory selektivní poskytují signál úměrný pouze koncentraci analyzované látky v eluátu, kdežto detektory univerzální signál úměrný určité vlastnosti eluátu jako celku, separovaných látek i mobilní fáze [26]. 
V současné praxi HPLC se standardně používají spektrofotometrické detektory pracující v ultrafialové, případně i ve viditelné oblasti elektromagnetického záření (od 190 do 600 nebo do 800 nm).
Vlnovou délku detekce u levnějších přístrojů s nízkotlakou rtuťovou výbojkou jako zdrojem záření vymezuje interferenční filtr (253,7 nm). Detektory vybavené deuteriovou výbojkou jako zdrojem spojitého záření a monochromátorem, umožňují zvolit vlnovou délku detekce, většinou v rozsahu od 190 do 600 nm. Některé přístroje tohoto typu umožňují snímat UV spektra látek v měrné kyvetě při zastaveném průtoku mobilní fáze (stop-flow technika), u rychle skenujících spektrofotometrů i bez přerušení toku.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Schema_detektoru_s_diodovym_polem_dad3ac0d2f/2-Theta-Obr-Schema-detektoru-s-diodovym-polem.jpg" alt="2 Theta: Obr. Schéma detektoru s diodovým polem; (1) záření ze zdroje, (2) štěrbina, (3) čočka, (4) clona, (5) měrná cela detektoru, (6) holografická mřížka, (7) pole fotodiod"/>
Spektrofotometrické jednopaprskové detektory s fotodiodvým polem (photodiode-array, PDA) mají velký počet (512 - 1024) plošných fotodiod, umístěných na křemíkové destičce o délce cca 1 - 2 cm, na něž dopadá záření po průchodu měrnou celou a spektrálním rozkladu holografickou mřížkou.
Vysoce selektivní a citlivé jsou fluorimetrické detektory. Fluoreskující látka v cele detektoru absorbuje budicí záření z ultrafialové oblasti, jehož část vyzáří ve formě sekundárního záření o vyšší vlnové délce, které se zpravidla měří pod úhlem 90° k záření budicímu.
Další skupinou selektivních a citlivých detektorů jsou detektory elektrochemické, které poskytují odezvu pro elektroaktivní, (redukovatelné či oxidovatelné) látky.
Amperometrické detektory pracují v rovnovážném stavu, kde na povrchu. měrné elektrody podléhá reakci jen malé množství látky. Vedle dvouelektrodového zapojení se používá i zapojení tříelektrodového s pomocnou elektrodou pro lepší stabilitu signálu. Měrná elektroda je zhotovena ze skelného uhlíku, grafitových vláken či grafitové pasty, platiny, zlata, mědi, niklu, nebo z drátů a disků, potažených různými amalgámy rtuti (podle typu elektrochemické reakce) a má buď tvar průtočné kapiláry, nebo disku či tyčinky s leštěným povrchem, obtékaným eluátem z kolony. Časem se zanáší reakčními produkty a je ji třeba pravidelně čistit. Miniaturizované měrné cely lze používat v mikrokolonové nebo kapilární HPLC. Detektory jsou selektivní a jejich citlivost je mnohdy srovnatelná s detektory fluorimetrickými, nehodí se ale pro použití při gradientové eluci. Ještě citlivější jsou coulometrické detektory, které pracují s průtočnými elektrodami ve formě frit z pórovitého grafitického uhlíku s vysokým měrným povrchem, na němž probíhají elektrochemické reakce analyzovaných látek.
Vodivostní detektory měří elektrickou vodivost eluátu z kolony v průtokové cele, obvykle válcového tvaru, se dvěma vzájemně izolovanými kovovými elektrodami. Pracují s vloženým střídavým napětím, aby nedocházelo k polarizaci elektrod. Používají se téměř výhradně pro detekci iontových látek při tzv. iontové chromatografii.
Pro látky, které nemají fyzikálně-chemické vlastnosti umožňující selektivní detekci, je třeba použít detektory univerzální. Z nich je nejstarší refraktometrický detektor, který při průchodu látky poskytuje odezvu úměrnou rozdílu indexu lomu mezi měrnou kyvetou a kyvetou srovnávací, naplněnou čistou mobilní fází.
Univerzálním detektorem je i aerosolový detektor rozptylu světla (evaporative light-scattering detector, ELSD), který využívá zmlžení eluátu z kolony v proudu dusíku za tvorby jemných kapiček aerosolu. Z nich se ve vyhřívané oblasti odpaří mobilní fáze a průtokovou celou prochází aerosol tuhých mikročástic vzorku v proudu plynu, na nichž dochází k rozptylu světla, které vychází z kolmo umístěného laserového zdroje.
Pro každou aplikaci je třeba optimalizovat teplotu odpařování mobilní fáze a průtok plynu. Stejného principu využívá víceúhlový rozptylový detektor (multi-angle light-scattering detector, MALSD), používaný při chromatografii syntetických polymerů, kde lze získat údaje o molekulové váze na základě porovnání intenzity rozptylového záření při třech nebo více úhlech dopadu budicího záření. Podobný ELSD je i CNLSD detektor (condensation nucleation light-scattering detector), kde po odpaření mobilní fáze kondenzují tuhé částice s přesycenou vodní parou na větší kapičky, čímž se zvětší rozptyl světla a zlepší citlivost detekce. Detektor nabitého aerosolu (charged aerosol detector, CAD) neměří rozptyl záření, ale působí na aerosol vysokonapěťovým koronovým výbojem na elektrodě, který aerosol ionizuje.
Rámec pouhé detekce přesahují přímé (on-line) kombinace HPLC se spektrálními technikami, s NMR [30] a především s hmotnostní spektrometrií (spojení HPLC-MS) [8], jejichž aplikace se stále rozšiřují. HPLC-MS techniky spojují výhody univerzální a vysoce selektivní detekce s možností identifikace složek vzorku, získání informací o molárních hmotnostech a o struktuře separovaných látek. Velký pokrok ve vývoji přímého spojení HPLC-MS znamenalo zavedení &quot;měkkých&quot; technik ionizace při atmosférickém tlaku, kdy nedochází k rozsáhlé fragmentaci a lze zaznamenat píky molekulových iontů či jejich aduktů i pro velmi polární a tepelně nestálé látky. Jedná se o ionizaci elektrosprejem (ESI) chemickou ionizaci při atmosférickém tlaku (APCI) a fotoionizaci při atmosférickém tlaku (APPI) či ionizaci-desorpcí laserem za podpory matrice (MALDI). Jako analyzátory se používají především kvadrupóly (Q), iontové pasti (IT), orbitální pasti a průletové analyzátory (TOF).
Přímé spojení HPLC-ESI MS se v dnešní době stalo široce využívanou standardní technikou, zejména pro biopolymery (peptidy, proteiny), které za podmínek ionizace tvoří vícenásobně nabité ionty, což umožňuje analyzovat i látky s molekulovými hmotnostmi až do cca 150 000.

Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 2/4 

<h5>5.10 Kapalinová chromatografie v plošném uspořádání: Chromatografie na papíru a na tenkých vrstvách</h5>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Kapalinová chromatografie v plošném uspořádání: Chromatografie na papíru a na tenkých vrstvách</h3>
Planární chromatografie je v klasickém provedení instrumentálně nenáročná a rozvíjela se již ve čtyřicátých a padesátých letech minulého století. Lože se stacionární fází zaujímá tenkou obdélníkovou vrstvu, která je u papírové chromatografie (PC) vymezená tloušťkou chromatografického papíru. Chromatografický papír (Schleicher-Schűll) tvoří téměř čistá celulózová vlákna (0,16 - 0,50 mm), bez pojiv. Je označen číslem podle hustoty (gramáže). Čím větší je hustota a tloušťka vrstvy, tím pomaleji papír „teče“ a separace trvá déle, ale zlepšuje se rozdělení látek a zvyšuje se možnost zatížení papírové vrstvy vzorkem. Dávkování vzorků na papír, vyvíjení a detekce separovaných skvrn látek se v podstatě řídí stejnými pravidly jako chromatografie na tenkých vrstvách adsorbentu.
Planární chromatografie se provádí v off-line režimu, což znamená, že základní kroky procesu (nanášení vzorku, vyvinutí desky, derivatizace, detekce, vyhodnocení) jsou nezávislé na sobě, čase a místě. Z toho vyplývají některé specifické výhody a velká flexibilita při výběru stacionárních a mobilních fází. 
<h5>Obecné výhody metody jsou:</h5>
<ul>
<li>paralelní analýza a vizuální porovnání více vzorků a standardů; 
</li>
<li>jednorázové použití stacionární fáze snižuje potřebu čištění vzorků; 
</li>
<li>možnost vícenásobné detekce bez nutnosti opakování procesu;
</li>
<li>pohodlná chemická derivatizace separovaných látek; 
</li>
<li>detekce biologické aktivity; 
</li>
<li>nízké náklady a rychlost.
</li>
</ul>
U klasické tenkovrstvé chromatografie (thin-layer chromatography, TLC) se pravidelná tenká vrstva 0,1 - 0,25 mm adsorbentu s relativně širokou disperzí částic pod 20 μm, nemodifikovaného silikagelu či silikagelu s chemicky navázanými alkylovými, aminovými, kyanovými a diolovými fázemi, jako u sloupcové kapalinové chromatografie. Stále se poměrně často používají i jiné adsorbenty: oxid hlinitý, polyamid, či celulózový prášek zpevněný škrobem, sádrou nebo arboxymethylcelulózou jako pojivem. K adsorbentu se někdy přidává fluorescenční indikátor pro usnadnění vizuální detekce – pod UV lampou se skvrny látek projeví zhášením fluorescence. Tenká vrstva adsorbentu je fixována na podložní hliníkové či skleněné destičce. Původně se vrstva adsorbentu nanášela ručně, v současné době se používají výhradně hotové chromatografické desky s prefixovanou vrstvou sorbentu, většinou o rozměrech 20x20, 20x10, a 10x5 cm.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Chromatografie_v_plosnem_usporadani_na_papiru_nebo_tenke_vrstve_61a38ced32/2-Theta-Chromatografie-v-plosnem-usporadani-(na-papiru-nebo-tenke-vrstve).jpg" alt="2 Theta: Chromatografie v plošném uspořádání (na papíru nebo tenké vrstvě)"/>
Na papíru nebo na destičce s tenkou vrstvou adsorbentu se nejprve označí místa na startovní linii, kam se nanese malý objem roztoku vzorku (1-5 μl). Ruční nanášení vzorků na start z injekční mikrostříkačky je v moderní technice TLC nahrazeno posuvným modulem s aplikační hlavou, v níž jsou upevněny skleněné dávkovací kapiláry.
Po odpaření rozpouštědla se papír či destička s natečkovanými vzorky umístí do uzavřené vertikální nebo horizontální chromatografické komory, kde se na ni zavádí směs rozpouštědel, která slouží jako vyvíjecí soustava (mobilní fáze), jejímiž parami je komora předem nasycena.
Na rozdíl od HPLC, kde se před dávkováním vzorku kolona vyrovná s mobilní fází, v klasické TLC se vzorky dávkují na suchou vrstvu a vyvíjení chromatogramu probíhá působením kapilárních sil v pórech vrstvy, buď v sestupném, nebo vzestupném uspořádání.
Skvrny vzorku mají kruhový tvar, někdy poněkud deformovaný protažením ve směru pohybu vyvíjecí soustavy – chvostování - a zaujmou různé polohy mezi startem a čelem na plošném chromatogramu a zviditelní se buď v ultrafialovém světle, nebo po barevné reakci, vyvolané postřikem vhodným detekčním činidlem. Poloha středu skvrny je charakteristická pro identitu látky, podobně jako eluční čas ve sloupcové chromatografii a vyhodnocuje se jako retardační faktor,
<h5>Shrnutí</h5>
Proti HPLC má TLC nevýhodu v hůře definovaném systému, nižší účinnosti separace, citlivosti a přesnosti stanovení. Výhodou je naopak analýza složitých matric vzorků (sacharidy, lipidy) bez předchozích zdlouhavých úprav a široká škála vzorků, které lze pomocí TLC/HPTLC určit. Dále možnost současné analýzy většího množství vzorků a opakovaného vyvíjení. Obzvláště v moderní TLC/HPTLC je velkou výhodou časová nenáročnost (díky stanovení několika vzorků najednou) a ekonomická úspora, protože oproti HPLC stačí malé množství rozpouštědel a není vždy nutné mít vysokou čistotu těchto rozpouštědel, jako je tomu u HPLC. Také robustnost metody je velikou výhodou. Nejen proto se TLC stále často využívá pro rychlý screening velkého počtu vzorků před případnou přesnější HPLC analýzou. Konečně v plošném uspořádání lze relativně snadno realizovat dvourozměrné separace. Po ukončení dělení v jednom směru se deska vysuší, otočí o 90° a částečně separovaný vzorek se podrobí separaci v jiné vyvíjecí soustavě v kolmém směru na původní směr vyvíjení, takže výsledkem je lepší pokrytí plochy tenké vrstvy a využití dostupného separačního prostoru pro složitý vzorek [2].

Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 4/4 (TLC)

<h4>10 SPEKTRÁLNÍ METODY</h4>
<h5>10.4 Ramanova spektrometrie</h5>
<ul>
<li>10.4.1 Teoretické základy</li>
<li>10.4.2 Experimentální uspořádání</li>
<li>10.4.3 Aplikace Ramanovy spektrometrie</li>
<li>10.4.3.1 Identifikace neznámých látek</li>
<li>10.4.3.2 Identifikace polymorfů, solvátů a solí</li>
<li>10.4.3.3 Ramanovo mapování a zobrazování</li>
<li>10.4.3.4 Další příklady aplikací Ramanovy spektrometrie</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Teoretické základy</h3>
Ramanova spektrometrie je stejně jako infračervená spektrometrie metodou vibrační spektrometrie. Pojmenována je podle sira prof. Chandrasekhara Venkata Ramana, který jako první spolu se sirem Kariamanickam Srinivasa Krišnanem pozoroval jev neelastického rozptylu světla. Za tento objev obdržel Raman v r. 1930 Nobelovu cenu za fyziku [1]. Nezávisle na Krišnanovi a Ramanovi pozorovali tento jev dva fyzici L. I. Mandelštam a G. S. Lansberg v tehdejším SSSR [2-5].
Pokud je kvantum energie molekulou absorbováno, dochází k přechodům označeným IR. Tyto přechody jsou sledovány infračervenou (IČ) spektrometrií. Druhou možností je, že k přechodům dochází během rozptylového efektu, který lze popsat jako absorpci fotonu a excitaci molekuly do nevlastního energetického stavu (virtuální hladiny) a bezprostřední relaxaci molekuly na nižší energetický stav spojenou s emisí fotonu rozptýleného. Celý tento děj trvá méně než 10¯¹⁵ sekundy. Pokud se molekula z excitovaného stavu vrací do stavu základního, foton, který vyzáří, má stejnou energii jako foton excitační a nenese žádnou informaci o vibračních stavech molekuly (Rayleighův rozptyl) [6-9].
V Ramanově i IČ spektrometrii záleží na rozdílu energií vibračních hladin. V IČ spektrometrii se uplatňuje foton s energií daného vibračního přechodu, zatímco v Ramanově spektrometrii se jedná o dvoufotonový proces, kde energii vibračního přechodu odpovídá rozdíl mezi energiemi fotonu „absorbovaného“ a „emitovaného“.
Módy s velikou změnou dipólového momentu, kterým v IČ spektrech odpovídají intenzivní pásy, poskytují v Ramanových spektrech obvykle málo intenzivní pásy. Naopak vibrace nepolárních funkčních skupin poskytují intenzivní pásy v Ramanových spektrech a slabé v IČ spektrech. Tyto dvě vibračně spektrální metody (IČ a Ramanova spektrometrie) se navzájem doplňují, říkáme, že jsou vzájemně komplementární.
V řadě případů není Ramanova spektrometrie používána jako samostatná metoda, ale v kombinaci s IČ spektrometrií ve střední oblasti (MIR) tak, aby bylo dosaženo kompletní spektrometrické informace o vzorku. Vhodným doplněním může být Ramanova spektrometrie pro strukturní analýzu organických molekul v kombinaci s nukleární magnetickou rezonancí (NMR), případně s hmotnostní spektrometrií.
Ramanova spektrometrie poskytuje klíčovou informaci o struktuře molekuly. Pozice a intenzity pásů ve vibračním spektru mohou být užity pro identifikaci funkčních skupin v molekule nebo pro potvrzení identity vzorku. S potřebnými znalostmi je možno identifikovat chemické sloučeniny nebo sledovat intermolekulární interakce vyhodnocováním změny pozice a intenzity Ramanových pásů. Je také možno identifikovat sloučeniny vyhledáváním v knihovnách spekter [např. 10]. V tom případě není nezbytně nutné interpretovat spektrum, ale spíše naměřit kvalitní spektrum, které bude porovnáváno se záznamy v knihovnách spekter. Různé krystalové modifikace se obvykle projevují změnou poloh maxim pásů ve spektru nebo změnou tvaru pásů.
<h3>Experimentální uspořádání</h3>
Základní uspořádání Ramanova spektrometru je znázorněno na obrázku 10.44. Excitační záření vychází ze (1) zdroje záření, postupuje na (2) vzorek. Rozptýlené fotony ze vzorku se přes (3) sběrnou optiku dostávají na (4) difrakční prvek nebo interferometr (dle druhu přístroje) a pokračují na (5) detektor.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Schema_usporadani_Ramanova_spektrometru_c4577e9f51/2-Theta-Obr-Schema-usporadani-Ramanova-spektrometru.jpg" alt="2 Theta: Obr. Schéma uspořádání Ramanova spektrometru"/>
Jako zdroje záření se obvykle používá laserů, které jsou schopny produkovat vysoce energetické koherentní záření [9]. Vlnová délka používaných excitačních laserů se pohybuje od IČ přes viditelnou až do UV oblasti. Směrem k nižším vlnovým délkám excitačního záření se zvyšuje intenzita Ramanova signálu, ale spolu s tím roste i riziko spojité emise vzorku – fluorescence, která může zcela znehodnotit měření překrytím Ramanova spektra.
Ramanova spektrometrie je metodou, která obvykle nevyžaduje zvláštní přípravu vzorků. Podle úhlu dopadu excitačního záření a sběru záření rozptýleného hovoříme nejčastěji o geometrii 90° nebo 180°.
Na rozdíl od IČ spektrometrie, kde je využíváno již téměř výhradně interferometrických systémů, se v Ramanově spektrometrii uplatňují systémy s disperzním prvkem (difrakční mřížkou) i s interferometrem [6]. Difrakční mřížka je obvykle destička s mnoha vrypy (hustota vrypů činí běžně řádově tisíce na jeden mm). Pro zpracování naměřených dat na spektra se u interferometrických systémů používá Fourierova transformace a takové spektrometry pak nesou označení FT.
<h3>Aplikace Ramanovy spektrometrie</h3>
<ul>
<li>Aplikace a literatura z oblasti Raman spektrometrie <a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=48">v knihovně LabRulezICPMS</a></li>
<li>Webináře z oblasti Raman spektrometrie <a href="https://icpms.cz/webinars?tags=44">v databázi LabRulezICPMS</a></li>
</ul>
<h5>IDENTIFIKACE NEZNÁMÝCH LÁTEK</h5>
V předchozích kapitolách o Ramanově spektrometrii byly nastíněny některé aplikace této techniky v laboratorní praxi. V následující kapitole budou jednotlivé aplikace přiblíženy a demonstrovány na případových studiích. Ramanova spektroskopie je metodou nedestruktivní analýzy. Její komplementarita s IČ spektrometrií a informace, které poskytuje o stavbě molekuly a krystalové struktuře, umožňují její využití při identifikaci neznámých vzorků. Každá funkční skupina vibruje určitou frekvencí. Tyto vibrace sledujeme způsobem popsaným výše. Z polohy intenzitního maxima ve spektru můžeme usuzovat na přítomnost konkrétních funkčních skupin.
Chemickou strukturu vzorku lze tedy odvodit rozborem spektra přiřazením pásů vibracím jednotlivých funkčních skupin, což vyžaduje určité znalosti a zkušenosti ve spektroskopii a také tabulky charakteristických frekvencí vibrací funkčních skupin, anebo je možno totožnost chemické struktury potvrdit srovnáním se záznamem spektra známé látky s potvrzenou strukturou (např. NMR), standardem, vyhledáváním v knihovnách spekter atd.
<h5>IDENTIFIKACE POLYMORFŮ, SOLVÁTŮ A SOLÍ</h5>
Ramanovou spektrometrií lze rozhodnout, zda se jedná o sůl molekuly, solvát nebo kokrystal. Solvát je tvořen molekulami látky, které jsou v krystalové mřížce uspořádány spolu s molekulami rozpouštědla. Zvláštním případem solvátů jsou hydráty, kdy krystalová mřížka obsahuje také molekuly vody. Kokrystal má uspořádání mřížky takové, že jsou v ní přítomny molekuly dvou nebo více různých látek, z nichž jsou všechny za běžných podmínek v pevném stavu, přičemž jejich uspořádání v mřížce není založeno na iontovém párování, nýbrž na slabších interakcích, jako jsou vodíkové můstky, π-π.stacking nebo van der Waalsovy interakce.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Porovnani_Ramanovych_spekter_dvou_soli_jantarat_a_vinan_molekuly_ucinne_latky_leciva_b0d70b9d5c/2-Theta-Obr-Porovnani-Ramanovych-spekter-dvou-soli-(jantarat-a-vinan)-molekuly-ucinne-latky-leciva..jpg" alt="2 Theta: Obr. Porovnání Ramanových spekter dvou solí (jantarát a vinan) molekuly účinné látky léčiva"/>
<h5>RAMANOVO MAPOVÁNÍ A ZOBRAZOVÁNÍ</h5>
V kapitole 10.4.2 byla zmíněna možnost spojení Ramanova spektrometru s mikroskopem. Takového uspořádání lze využít pro analýzu vzorků s minimální velikostí přibližně jeden mikrometr, v některých speciálních případech jako je TERS, který se ale rutinně nepoužívá a nalézá uplatnění spíše v primárním výzkumu, se dostáváme až k řádu nanometrů. Pod mikroskopem můžeme identifikovat neznámé částice, vlasové nebo velmi malé nečistoty v pevných vzorcích nebo kapalinách podobně jako ve větším měřítku, jak bylo popsáno v kapitole 10.4.3.1. Zásadní význam spojení s mikroskopem má také možnost mapování. Na povrchu měřeného materiálu se nasbírají spektra v definovaných bodech s pravidelnými rozestupy. Pokud jsou měřené body v přímce, hovoříme o liniovém mapování. Tím můžeme snadno odhalit gradient koncentrace nějaké složky, např. při jejím průniku do složky jiné. Charakter liniového mapování má i hloubkové mapování, popsané v kap. 10.4.2. Pokud jsou body definované pro měření po části nebo po celém povrchu, hovoříme o mapování plošném. To má zásadní význam všude, kde je potřeba sledovat homogenitu povrchů, distribuci složek apod. Obrázek 10.50 je tvořen Ramanovou mapou řezu farmaceutickou tabletou.
<h5>DALŠÍ PŘÍKLADY APLIKACÍ RAMANOVY SPEKTROMETRIE</h5>
Vedle chemického průmyslu a výzkumu, kde z výše uvedených důvodů nachází Ramanova spektrometrie velmi široké uplatnění, existuje řada odvětví, kde hraje tato technika analýzy nezastupitelnou roli. V klinických, medicínských a biologických aplikacích je Ramanovy spektrometrie využíváno zejména pro její neinvazivnost, nedestruktivnost a rychlost měření k analýze tkání. Jsou prováděny studie ke stanovení karotenoidů jako preventivních molekul zabraňujícím radikálovým reakcím přímo přiložením pokožky k laseru spektrometru. Ramanova spektrometrie je testována na včasný záchyt melanomu pokožky analýzou pigmentových znamének, vyvíjí se metoda pro analýzu možných tělísek rakoviny prsu přímo v těle a některé analýzy tělních tekutin mají vést také ke včasnému odhalení chorob organismu. Ramanovou spektroskopií lze sledovat změny jak ve tkáních, tak v pletivech.

Organická analýza - Spektrální metody (Ramanova spektrometrie)

<h5>10.3 Infračervená spektroskopie</h5>
<ul>
<li>10.3.1 Princip</li>
<li>10.3.2 Jak měřit infračervená spektra</li>
<li>10.3.3 Co lze vyčíst z infračervených spekter</li>
<li>Závěr</li>
</ul>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Infračervená spektroskopie</h3>
<h5>Princip</h5>
Infračervená spektroskopie je metodou nedestruktivní. To znamená, že samotnou analýzou se vzorek nijak nepoškodí. Přesto touto metodou můžeme získat údaje nejen o složení vzorku ale i o jeho molekulové struktuře. Infračervená spektroskopie je založena na interakci elektromagnetického záření s měřeným vzorkem. Za infračervené se považuje elektromagnetické záření v rozsahu vlnočtů 12 500 až 20 cm¯¹ , což odpovídá rozsahu vlnových délek 800 nm až 0,5 mm. Infračervené záření je tedy oblastí mezi zářením viditelným (menší vlnové délky) na jedné straně a zářením mikrovlnným (větší vlnové délky) na straně druhé. Z praktických důvodů infračervenou spektroskopii dělíme podle vlnových délek záření na dalekou (FIR z angl. far infrared), střední (MIR z angl. middle infrared) a blízkou (NIR z angl. near infrared). Pro praktické využití má největší význam střední infračervená oblast (4000 až 400 cm¯¹). Energie tohoto záření je dostatečně velká na to, aby jeho absorpce způsobila změny rotačních a vibračních stavů přítomných molekul. Může tedy docházet jak ke zvětšení amplitudy vibrace molekul vzorku, tak ke zrychlení jejich rotace. Tyto vibrační a rotační přechody tvoří teoretický základ infračervené spektroskopie. Přechody mohou být jak čistě vibrační, tak čistě rotační či kombinované vibračně-rotační. Protože čistě rotační přechody leží ve vzdálené infračervené, příp. mikrovlnné oblasti (do 40 cm¯¹), mají pro praktické využití význam zejména přechody čistě vibrační a kombinované.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Elektromagneticke_zareni_8c3437c7f1/2-Theta-Obr-Elektromagneticke-zareni.jpg" alt="2 Theta: Obr. Elektromagnetické záření"/>
Tyto vibrační a vibračně-rotační přechody se projeví v infračervených spektrech jako absorpční pásy definované vlnočtem a intenzitou absorpce. Vlnočet je převrácená hodnota vlnové délky záření a udává se buď jako maximum pásu nebo interval vlnočtů, kde se pás nachází. Intenzita absorpce se nejčastěji vyjadřuje jako absorbance či transmitance.
<h5>Jak měřit infračervená spektra</h5>
Infračervená spektra lze měřit u látek prakticky všech forem. Pokud máme potřebné vybavení, nejsme omezeni skupenstvím (pevné, kapalné, tuhé), ani dalšími specifiky vzorku, takže můžeme měřit čisté látky, jejich roztoky i směsi. Nezáleží ani na původu či povaze vzorku, umíme měřit látky anorganické, organické i biologického původu. Základní podmínkou získání kvalitního infračerveného spektra je ale vždy správná úprava vzorku úzce související také s výběrem hodné techniky měření. Např. při přípravě roztoků pro měření infračervených spekter je nutno mít na paměti následující zásady pro výběr vhodného rozpouštědla. Předně musí být použité rozpouštědlo propustné pro infračervené záření. Měřená látka v něm musí být dobře rozpustná, ale neměla by s rozpouštědlem nijak reagovat. Rozpouštědlo také nesmí interagovat s kyvetou, zde je nutno věnovat zvýšenou pozornost výběru okének, která mohou být vyrobena z několika různých materiálů.
Infračervená spektra mohou být získána použitím řady různých technik a speciálních (přídavných) zařízení, které umožňují analýzu celé škály vzorků různých forem. Nepoužívanější technikou je měření tzv. na průchod, při kterém infračervené záření prochází tenkou vrstvou vhodně upraveného vzorku. U kapalných a plynných vzorků se používají speciální kyvety, které jsou často rozebíratelné, takže u nich lze měnit okénka různých materiálů, a mohou být též temperované či s regulací tlaku. U pevných vzorků se měří tenké vrstvy ve formě destiček či fólií, práškové vzorky se mísí s KBr a lisují do tablet.
<ul>
<li><a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=89&amp;search=specular+reflectance">Zrcadlová reflektance</a> je technika založená na měření změny intenzity záření odraženého od lesklé podložky, na které je umístěn nebo nanesen vzorek.</li>
<li><a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=89&amp;search=ATR">Techniky ATR</a> (zeslabený úplný odraz) a FMIR (násobný odraz) využívají charakteristické zeslabení (absorpce) infračerveného záření při jeho úplném odrazu na styčné plošce měrného hranolu a vzorku.</li>
<li><a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=89&amp;search=reflectance+diffuse">Difúzní reflektance</a> je technika využívající měření záření rozptýleného odrazem od vzorku.</li>
<li><a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=89-98&amp;search=ATR">FTIR mikroskopie</a> se používá všude tam, kde nás zajímá prostorové rozložení struktury a vlastností.</li>
</ul>
<h5>Co lze vyčíst z infračervených spekter</h5>
Infračervená spektroskopie nabízí díky mnoha různým technikám rychlou a citlivou analýzu celé škály různých materiálů. V získaných infračervených spektrech je uložena řada informací využitelných pro kvalitativní i kvantitativní analýzu. V praxi se často uchylujeme pouze ke kvalitativní analýze a Infračervenou spektroskopii využíváme k identifikaci strukturních přítomných ve vzorku. Hledáme tak odpověď na otázku, které funkční skupiny jsou v molekulách vzorku obsaženy či o jakou látku se jedná. Často nám v identifikaci pomohou dodatečné informace o původu, elementárním složení apod.
Pro kvalitativní analýzu jsou nezbytné dvě základní v praxi ověřené skutečnosti. První je, že každá látka má své vlastní infračervené spektrum, které liší od spekter ostatních látek. Proto můžeme jednotlivé sloučeniny identifikovat pomocí atlasů a knihoven spekter. V tomto případě je ale podmínkou měření vzorku stejnou technikou a za stejných podmínek, jako bylo měřeno spektrum uvedené v atlasu či knihovně. Druhou významnou pomůckou je, že stejné funkční skupiny se ve spektrech různých látek projevují podobně. Proto můžeme z infračerveného spektra zjistit přítomnost jednotlivých funkčních skupin či strukturních jednotek nebo jejich výskyt vyloučit.
V dalším textu si popíšeme obvyklý postup při rozboru infračerveného spektra. Jako první posoudíme jakýsi celkový dojem. Zodpovíme si základní otázky jako: Je spektrum složité či jednoduché? Má mnoho nebo málo pásů? Mají některé pásy výrazně vyšší intenzitu než ostatní? jsou pásy široké či úzké? Překrývají se? Z tohoto celkového dojmu pak můžeme usuzovat na složitost struktury, počet funkčních skupin či přítomnost vodíkových vazeb. Pokud je spektrum jednoduché s malým počtem pádů, zřejmě se jedná o malou molekulu s poměrně jednoduchou strukturou a naopak.
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://gcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>

Organická analýza - Infračervená spektroskopie (IR)

<h5>7.3 Spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií</h5>
<ul>
<li>7.3.1 Instrumentace pro LC/MS</li>
</ul>
<h5>7.4 Spojení superkritické fluidní chromatografie s hmotnostní spektrometrií</h5>
<blockquote>
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
</blockquote>
<blockquote>
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
</blockquote>
<h3>Spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií</h3>
Spojení těchto dvou technik bylo podstatně problémovější než u plynové chromatografie. Důvodem bylo jednak skupenství mobilní fáze, jednak i některé vlastnosti látek separovaných kapalinovou chromatografií (termolabilita, vyšší molekulová hmotnost, polarita). Během času bylo navrženo poměrně velké množství různých více či méně úspěšných iontových zdrojů, jejichž kompletní výčet přesahuje rámec tohoto textu, a proto bude zmíněno jen několik nejvýznamnějších.
Konkrétní volba iontového zdroje je dána povahou analyzovaných látek a s tím související volbou chromatografického separačního systému. Rámcově ji naznačuje Obrázek níže. Elektrosprej je v podstatě metoda převodu iontů z kapalné do plynné fáze, nelze tedy použít pro látky, které v roztoku nejsou disociovány nebo alespoň nejsou disociovatelné, je tedy vhodný pro sloučeniny středně až silně polární. Díky schopnosti produkce vícenásobně nabitých iontů umožňuje analyzovat sloučeniny až do hmotnosti řádku 10⁵ Da. Pro méně polární sloučeniny je použitelná chemická ionizace za atmosférického tlaku a prakticky nepolární sloučeniny mohou být úspěšně ionizovány fotoionizací za atmosférického tlaku. Překryvy využitelných rozsahů jednotlivých technik naznačují, že jedna látka může být efektivně ionizována více způsoby.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_Theta_Obr_Vyuzitelnost_nejdulezitejsich_ionizacnich_technik_pro_LC_MS_67d2d0bede/2-Theta-Obr-Vyuzitelnost-nejdulezitejsich-ionizacnich-technik-pro-LC-MS.jpg" alt="2 Theta: Obr. Využitelnost nejdůležitějších ionizačních technik pro LC/MS"/>
<h4>Instrumentace pro LC/MS</h4>
Pro spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií jsou využívány prakticky všechny typy analyzátorů (včetně sférické iontové pasti). Využití měkkých ionizačních technik, kdy jsou produkovány převážně až výhradně kvazimolekulární, případně aduktové ionty, klade zvýšené nároky na identifikaci, což lze řešit pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie. U jednoduchého kvadrupólu je možnost využití tzv. fragmentoru – zvýšením potenciálového spádu mezi výstupem z kapiláry a prvním skimmerem se zintenzivní kolize iontů s neutrálními molekulami, jichž je v této oblasti ještě poměrně dost, což vyvolá fragmentaci. Díky předchozí separaci, kdy sloučeniny vstupují do iontového zdroje vesměs jako oddělené zóny, se takto může přispět k objasnění struktury. Významným přínosem je rovněž využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie, které jednak minimalizuje potenciální interference, jednak poskytuje informaci o sumárním vzorci daného iontu. Klasickými vysokorozlišovacími analyzátory jsou sektorové s dvojí fokusací, nejvyšší dosažitelnou rozlišovací schopností (ale také nejvyšší cenou) se vyznačují hmotnostní spektrometry na bázi iontové cyklotronové rezonance s Fourierovou transformací, následované Orbitrapem, ale velice uspokojivé parametry nabízejí i analyzátory doby letu. Velmi úspěšné jsou v této oblasti rovněž hybridní analyzátory (Q-TOF).
<blockquote>
<ul>
<li>💡 <a href="https://lcms.cz/products?instrumentationItems=31">Přehled instrumentace spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie</a></li>
<li>💡 <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31">Přehled aplikací spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie</a></li>
</ul>
</blockquote>
<h3>Spojení superkritické fluidní chromatografie s hmotnostní spektrometrií</h3>
Spojení SFC/MS je oproti GC/MS a LC/MS poněkud komplikovanější. V důsledku dekomprese mobilní fáze při přechodu z nadkritických podmínek v separační koloně do pracovního tlaku v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru výrazně klesá solvatační schopnost mobilní fáze, což může způsobit až precipitaci separovaných látek, vedoucí ke snížení účinnosti převodu hmoty, zhoršení tvaru chromatografických píků a ke vzniku paměťového efektu mezi za sebou následujícími analýzami.
Úspěšné spojení SFC s hmotnostní spektrometrií využívající přímého vstupu mobilní fáze do MS a chemickou nebo elektronovou ionizaci bylo popsáno počátkem 90. let minulého století [34, 35]. To bylo ale využitelné pouze pro čistý CO2. V současnosti se využívají techniky ionizace za atmosférického tlaku, kterým organické modifikátory nevadí. Frekvence využívání je obdobná jako u LC/MS: dominuje elektrosprej (74 %) následovaný APCI (21 %) a APPI (1,9 %) [36]. Problém se změnou tlaku mezi separační kolonou a iontovým zdrojem byl vyřešen přidáváním pomocné kapaliny k mobilní fázi za separační kolonou, ale před regulátorem zpětného tlaku. Tato směs pak může být vedena do iontového zdroje přímo nebo přes dělič umístěný před regulátorem zpětného tlaku [37]. Jako pomocná kapalina se nejčastěji využívá methanol, k němuž mohou být pro podporu ionizace přidávána různá snadno disociovatelná aditiva (amoniak, organické kyseliny, amonné soli organických kyselin, případně voda) [36].

Organická analýza - Spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC/MS)

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

2 THETA ASE, s.r.o. byla založena v roce 2000. Rozsah jejích činností zahrnuje obchod s laboratorními přístroji, vybavením laboratoří, referenčními materiály, nástroji a zařízením pro odběr a úpravu vzorků, atd. Firma také organizuje odborné a vzdělávací akce a zajišťuje pomoc při aplikacích mikrovlnné techniky ve výzkumu a výrobě. 

2 THETA ASE

Odběry vzorků 2026

DataApex at ISC 2026

Waters at ISC 2026

Measuring what matters: water quality analysis with UV-Visible spectrophotometry

Advantages of microbore column use in ion chromatography

Mastering Geological Sample Preparation: Strategies for Complete Digestion and Low Blanks