Každý SPE mechanismus/fáze má obecný soubor doporučených rozpouštědel, se kterými lze extrakci provést. Použijte rozpouštědla/podmínky pH uvedené níže, objemy stanovené v sekci <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://discover.phenomenex.com/spe-technical-tip-part2-cz?elqTrackId=29226FEFC5A60FEE662A3AFFB8145DA7&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4392&amp;elqat=2&amp;elqCampaignId=&amp;elqak=8AF5CFFF4EA7A7AB7A790F6665CFD43E0ECFCF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0">Metod a Výběr objemu sorbentu.</a><h4>SPE metoda pro reverzní fázi</h4><h5>Sorbent - SDB-L, C18, C8, PH, CN, X, XL</h5><ul><li>Vlastnosti analytu: Nízká až střední polarita (nebo nepolární) Hydrofóbní neutralizovaný/nenabitý - Léčiva, pesticidy, herbicidy</li><li>Vzorek/Matrix: Vodné, ředěné pufrem - Biologicé roztoky, voda</li><li>Přípravný krok<ul><li>Solvace – polární organická rozpouštědla - Metanol</li><li>Ekvilibrace – vodné, pufry - Voda nebo pufr</li></ul></li><li>Promývací krok: Vodné pufry s 5 až 50 % polární organickou příměsí - Metanol:Voda (5:95)</li><li>Eluční krok: Polární nebo nepolární organická rozpouštědla s nebo bez vody, pufru a/nebo silné kyseliny či zásady - Metanol:Acetontril (50:50)</li></ul><h4>SPE metoda pro normální fázi</h4><h5>Sorbent - Silica, Florisil®, NH2, CN</h5><ul><li>Vlastnosti analytu: Sloučeniny střední až vysoké polarity (neutralizované/nenabité) – Pesticidy</li><li>Vzorek/Matrix: Nepolární organická rozpouštědla nebo středně polární organická rozpouštědla – Hexan, chloroform, petrolether, toluen nebo methylenchlorid</li><li>Přípravný krok<ul><li>Solvatace – polární organická rozpouštědla (volitelné) – Metanol (volitelné)</li><li>Ekvilibrace – rozpouštědlo vzorku/matrice – Hexan nebo chloroform</li></ul></li><li>Promývací krok: Nepolární organická rozpouštědla s nízkou koncentrací (1 až 5 %) organického rozpouštědla střední až nízké polarity – Hexan s 1 % THF, ethylacetát, aceton, acetonitril nebo IPA</li><li>Eluční krok: Nepolární organická rozpouštědla obsahující vyšší koncentraci (5 až 50 %) středně až vysoce polárních organických rozpouštědel – Hexan s 10 % THF, ethylacetát, aceton, acetonitril nebo IPA</li></ul><h4>SPE metoda pro silný iontoměnič</h4><h5>Sorbet:&nbsp;Aniontová výměna: Screen-A, SAX, X-A, X-AW, XL-A, XL-AW Kationtová výměna: Screen-C, SCX, X-C, X-CW, XL-C, XL-CW</h5><ul><li>Vlastnosti analytu: Ionizované/nabité látky – Aniontová výměna: Kyselý analyt</li><li>Kationtová výměna: Bazický analyt</li><li>Vzorek/Matrix: Vodný; Pufry s nízkou iontovou silou (&gt; 30 mM), pH upraveno – Biologické tekutiny s pufrem</li><li>Přípravný krok&nbsp;<ul><li>Kondicionace – polární organická rozpouštědla – Metanol</li><li>Ekvilibrace – pufry s nízkou iontovou silou, pH upraveno – 25 mM Tris-OAc, pH 7</li></ul></li><li>Promývací krok: Vodné pufry s nízkou koncentrací solí s nebo bez organického rozpouštědla&nbsp;<ul><li>Aniontová výměna&nbsp;<ul><li>Pufr pH 7: Metanol (50:50)</li></ul></li><li>Kationtová výměna<ul><li>Pufr pH 6</li><li>1M kyselina octová</li><li>Metanol</li></ul></li></ul></li><li>Eluční krok<ul><li>Neutralizujte náboj na slabém aniontu nebo kationtu</li><li>Zvyšte iontovou sílu a koncentraci protiiontů</li><li>Přidejte silný vytěsňovač protiiontů&nbsp;<ul><li>Aniontová výměna – Hexan:ethylacetát (75:25) + 1 % ledová kyselina octová</li><li>Kationtová výměna – Methanol + 5 % NH3</li></ul></li></ul></li></ul><blockquote>POZNÁMKA: Toto jsou obecné výchozí podmínky. Pro další pomoc <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://discover.phenomenex.com/customersupportEU?elqTrackId=E77367916EB097F21410859976B9364C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4392&amp;elqat=2&amp;elqCampaignId=&amp;elqak=8AF505951C4408055571313E3C6D3EBAD7D4CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0">se prosím obraťte</a> na svého technického poradce Phenomenex.</blockquote>

Obecná SPE metoda dle retenčního mechanismu

Extrakce na pevné fázi se rutinně volí jako technika přípravy vzorku před analýzou HPLC a GC. Poskytuje:<ul><li>Přečistění</li><li>Pre-koncentraci analytů</li><li>Výměnu rozpouštědla</li></ul>To funguje dobře pro jakékoli homogenní kapalné vzorky, ale nerozpustný vzorek jednoznačně nelze aplikovat přímo na zařízení SPE. Zde zvážujeme, jak nejlépe přistupovat k manipulaci s nerozpustnými vzorky před SPE.První stupeň předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci nerozpustného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Rozpouštědlo vybrané pro tento účelby mělo:<ul><li>Být efektivní při rozpouštění analytu</li><li>Být efektivní při rozpouštění matrice vzorku, i když to není nutné, pokud je vzorek dobře smíchán s rozpouštědlem</li><li>V ideálním případě být slabé rozpouštědlo, pokud jde o fázi SPE. To nemusí být vždy možné a proto někdy musí být vzorek před nanesením do SPE zkumavky vzorek odpařen a rekonstituován</li></ul>Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu, aby se podpořilo důkladné promíchání, a poté odstředěn, aby nerozpustné složky matrice sedimentovaly. Rozpouštědlo by pak mělo být odebráno pro další zpracování.V tomto okamžiku je třeba zvolit mechanismus SPE:<h4>SPE metoda na reverzních fázích</h4><h5>Mechanismus &nbsp;/&nbsp;&nbsp;Slabé rozpouštědlo &nbsp;/&nbsp;&nbsp;Silné rozpouštědlo</h5><ul><li>Reverzní fáze - Voda/pufr - Acetonitril/Metanol (hexan jako nejsilnější)</li><li>Normální fáze - Hexane/Heptan - Středně polární organická rozpouštědla jako DCM, MTBE, IPA (voda jako nejsilnější)</li><li>Iontová výměna - Vodný pufr o pH, které podporuje iontově výměnné interakce mezi analytem a SPE sorbentem - Organické rozpouštědlo, typicky methanol s úpravou pH k narušení iontoměničových interakcí</li></ul>V tomto bodě je třeba vzít v úvahu vlastnosti analytu i ředidlo vzorku. Extrakce na reverzních fázích jsou účinné pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, jako je voda. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středopolárním rozpouštědle, bude nutné vzorek buď naředit, nebo alternativně odpařit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kde je třeba vzorky rozpustit v hexanu/heptanu, aby se analyty úspěšně zachytily během nanášení vzorku do SPE zkumavky.<h5>Tyto příklady snad tento koncept ilustrují.</h5>1) Extrakce PCBs z půdyPCBs jsou hydrofobní a snadno se rozpouštějí v nepolárním rozpouštědle. Půdu lze vysušit, zvážit a poté extrahovat pomocí hexanu (nebo heptanu). Po důkladném promíchání a odstředění může být výsledný roztok aplikován přímo do kondicionované silikátové SPE zkumavky umožňující provedení extrakce na normální fázi.2) &nbsp;Tylosin z masaTylosin je antibiotikum s log P 1,0. Extrakce z masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) naruší jakékoli hydrofobní interakce uvolňují tylosin. Po odstředění bude výsledný kapalný vzorek vyžadovat další ředění vodou, aby se snížila síla nanášeného rozpouštědla před extrakcí s reverzní fází.3) Enilkonazol z pomerančůEnilconazol je fungicid široce používaný v zemědělství a často se používá s citrusovými plody. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Protože enilkonazol je zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímé zadržování na silném kationtoměničovém materiálu SPE. To značně zjednodušuje proces extrakce, protože není vyžadováno žádné ředění vzorku (na rozdíl od reverzní fáze nebo extrakce na normální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by analyt během nanášení nebyl zadržen).<blockquote>Pro další rady nebo návrhy týkající se přípravy vzorků navštivte: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="http://www.phenomenex.com/techniques/solid-phase-extraction">www.phenomenex.com/techniques/solid-phase-extraction</a></blockquote>

Možnosti ke zvážení v případě práce s nerozpustnými vzorky a SPE

Normal phase SPE (extrakce na normální fázi) využívá polární interakce jako retenční mechanismus. Tyto interakce zahrnují vodíkové vazby, dipól-dipól interakce, indukovaný dipól, π-π interakce atd. Dochází k nim mezi polárními funkčními skupinami analytů a polárními sorbenty.Reversed phase SPE (extrakce na reverzní fázi) využívá nepolární, hydrofobní interakce. Tyto interakce zahrnují Van der Waalsovy síly, disperzní síly (Londonovy síly), π-π interakce atd. Probíhají mezi uhlovodíkovými, hydrofobními částmi analytů i sorbentu.Při práci s matricemi vzorků rozpustnými pouze v organických rozpouštědlech se obvykle volí metoda na normální fázi. Příklady takových matric jsou oleje, tuky nebo máslo.V ideálním případě se vzorek před nanesením na sorbent naředí nepolárním rozpouštědlem (např. hexanem). Poté může být promyt hexanem nebo 5% dichlormethanem v hexanu (analogicky k promývání 5% MeOH ve vodě v metodách reverzní fáze za účelem odstranění interferencí matrice). Eluce se následně provádí polárním rozpouštědlem, které přeruší polární interakce mezi analytem a sorbentem.Frakcionace může být provedena použitím rozpouštědel v pořadí rostoucí polarity, nebo směsí rozpouštědel s různou polaritou.Níže je uveden stručný přehled rozpouštědel podle vzrůstající polarity, používaných při SPE na normální fázi:<h3>Rozpouštědla podle polarity</h3>Od nízké po vysokou polaritu:<ul><li>Hexan</li><li>Isooktan</li><li>Tetrachlormethan</li><li>Toluen</li><li>Benzen</li><li>t-butyl methyl ether</li><li>Chloroform</li><li>Dichlormethan</li><li>Diethylether</li><li>Ethylacetát</li><li>Tetrahydrofuran (THF)</li><li>Aceton</li><li>Acetonitril</li><li>40 % MeOH v acetonitrilu</li><li>20 % MeOH v diethyletheru</li><li>20 % MeOH v dichlormethanu</li><li>Isopropanol</li><li>Methanol</li><li>Voda</li><li>Kyselina octová</li></ul>

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Při stanovení potřebného množství sorbentu pro extrakci na pevné fázi (SPE) je nezbytné zohlednit matrici vzorku (např. sérum, plazma, moč, sliny, potraviny, říční voda, půda atd.). Na základě těchto informací a s využitím vhodné přehledové tabulky lze určit optimální hmotnost SPE sorbentu. Tyto tabulky odrážejí relativní obsah rušivých endogenních složek přítomných ve vzorcích.SPE zařízení musí mít dostatečnou kapacitu pro zachycení všech cílových analytů, stejně jako dalších látek z matrice, které se mohou na sorbent vázat obdobným typem interakce. Pokud je množství sorbentu nedostatečné, může při aplikaci vzorku dojít k průchodu části analytu sorbentem bez navázání, což vede ke snížené výtěžnosti a nižší reprodukovatelnosti mezi jednotlivými analýzami.<h3>Objem vzorku</h3><h4>Určuje hmotnost sorbentu/objem rozpouštědla</h4><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg" alt="Phenomenex: Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE zařízení? Závisí to na koncentraci analytu?" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg 154w," sizes="100vw" width="983" height="992"><h3>Obecné zatížitelnosti sorbentů:</h3><h4>Polymerní sorbenty: 10–15 % celkové hmotnosti sorbentu &nbsp;|&nbsp; Silikátové sorbenty: 5 % celkové hmotnosti sorbentu</h4>Například při použití 60 mg polymerního sorbentu (např.<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Strata"> Strata™-X</a>) lze aplikovat přibližně 500 µl plazmy. Na tentýž sorbent lze ovšem zavést až 2 ml moči, což dokládá, že moč obsahuje výrazně méně rušivých složek než plazma.U typů vzorků, které nejsou zahrnuty v doporučených tabulkách, se doporučuje vycházet z uvedených obecných pravidel – 5 % hmotnosti sorbentu pro silikátové materiály, resp. 10–15 % pro polymerní sorbenty. Rozdíl mezi kapacitou silikátových a polymerních sorbentů je dán jednak vyšším specifickým povrchem polymerních materiálů, jednak vyšší hustotou ligandů – celý povrch polymeru slouží jako stacionární fáze, zatímco u silikátového materiálu se na extrakčním mechanismu reverzní fáze nebo iontové výměny podílí navázaná fáze.

Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE? Závisí to na koncentraci analytu?

<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">Extrakce na pevné fázi</a> (SPE) je běžně volenou metodou přípravy vzorků před analýzou pomocí HPLC a GC. Poskytuje:<ul><li>Čištění vzorku;</li><li>Předkoncentraci analyzované látky;</li><li>Výměnu rozpouštědla.</li></ul>Tato metoda dobře funguje pro homogenní kapalné vzorky, avšak je zřejmé, že pevný vzorek nelze přímo aplikovat na SPE zařízení. V tomto textu se zaměříme na to, jak nejlépe přistupovat k přípravě pevných vzorků před SPE.První fáze předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci pevného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Vybrané rozpouštědlo by mělo:<ul><li>Účinně rozpouštět analyt;</li><li>Účinně rozpouštět matrici vzorku (i když to není nezbytné, pokud je vzorek dobře promíchán s rozpouštědlem);</li><li>Ideálně být slabým rozpouštědlem z pohledu následující SPE fáze. To však nemusí být vždy možné, a proto může být nutné vzorek vysušit a následně rekonstituovat před aplikací na SPE kolonu.</li></ul>Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu pro důkladné promísení a následně centrifugován, aby se usadily nerozpustné složky matrice. Supernatant (kapalná fáze) se poté oddělí a dále zpracovává.V tomto okamžiku je nutné zvolit odpovídající SPE mechanismus:<h3>Metoda reverzní fáze SPE</h3><h4>Mechanismus / slabé rozpouštědlo / silné rozpouštědlo</h4><ul><li>Reverzní fáze – voda/pufr – acetonitril/methanol (nejsilnější je hexan)</li><li>Normální fáze – hexan/heptan – středně polární organická rozpouštědla, jako je DCM, MTBE, IPA (nejsilnější je voda)</li><li>Iontová výměna – vodný pufr s pH, které podporuje iontové výměnné interakce mezi analyzovanou látkou a sorbentem SPE – organické rozpouštědlo, obvykle methanol s úpravou pH pro narušení iontových výměnných interakcí.</li></ul>V tomto bodě je třeba vzít v úvahu jak vlastnosti analytu, tak i rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku. Extrakce na reverzní fázi je účinná pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, např. ve vodě. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středně polárním rozpouštědle, je třeba jej buď zředit, nebo vysušit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kdy musí být vzorky rozpuštěny v hexanu nebo heptanu, aby bylo dosaženo účinné retence analytu během nanášení vzorku na SPE zařízení.Následující příklady mají tento princip ilustrovat:<h4>Extrakce PCB z půdy</h4>PCB jsou hydrofobní a dobře se rozpouštějí v nepolárních rozpouštědlech. Zeminu lze vysušit, zvážit a extrahovat pomocí hexanu nebo heptanu. Po důkladném promíchání a centrifugaci lze získaný roztok aplikovat přímo na kondicionovanou SPE kolonku se silikagelem, čímž se provede extrakce na &nbsp;normální fázi.<h4>Tylosin z masa</h4>Tylosin je antibiotikum s hodnotou log P = 1,0. Extrakcí masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) dojde k narušení hydrofobních interakcí a uvolnění tylosinu. Po centrifugaci bude nutné další naředění vodou, aby se snížila síla rozpouštědla před extrakcí na reverní fázi.<h4>Enilkonazol z pomerančů</h4>Enilkonazol je fungicid běžně používaný v zemědělství, zejména u citrusových plodů. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Jelikož je enilkonazol zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímou retenci na SPE sorbentu se silnými katexovými vlastnostmi (SCX). Tento postup výrazně zjednodušuje extrakci, protože není potřeba žádné ředění vzorku (na rozdíl od extrakce na reverzní nebonormální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by se analyt během nanášení nezachytil).

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Vzhledem ke své povaze vyžadují bioanalytické vzorky často předběžnou úpravu před dalším čištěním pomocí extrakce na pevné fázi (SPE). Každá matrice vzorku představuje své specifické výzvy, jako je odstranění bílkovin z plazmy a séra, rozklad červených krvinek v celé krvi, hydrolýza glukuronidovaných analytů v moči a homogenizace tkáňových vzorků. Tato technická poznámka popisuje běžné postupy předúpravy bioanalytických vzorků.<h4>Plazma/sérum</h4>Předúprava plazmy a séra závisí na povaze analytu. Pokud je analytem kyselina, lze k narušení interakce léčiva s bílkovinami použít 2% kyselinu fosforečnou (20 µl 85% H₃PO₄ na 1 ml plazmy nebo séra). Pokud je analyt zásaditý, použije se 0,1 M hydroxid sodný. Po přidání kyseliny nebo zásady se vzorek promíchá na vortexu po dobu 20–30 sekund a poté odstředí. Supernatant je poté připraven k další analýze.<h4>Celá krev</h4>Pro celou krev existuje několik možných předúprav. Pokud je cílový analyt přítomen v červených krvinkách, je nezbytný krok hemolýzy.<ul><li>Hemolýza: K 0,2 ml celé krve (s analytickým standardem a vnitřním standardem) ve zkumavce o objemu 1,2 ml přidejte 400 µl 2% roztoku síranu zinečnatého/80% methanolu. Promíchejte na vortexu 10–20 sekund a centrifugujte při 14 000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant odeberte k další analýze. Příprava roztoku síranu zinečnatého/methanolu: Do 100ml odměrné baňky přidejte 20 ml vody a 3,6 g ZnSO₄·7H₂O. Po rozpuštění přidejte 100% methanol. Roztok uchovávejte při 2–8 °C po dobu až 7 dnů.</li><li>Osmotický rozklad: Do 1 ml celé krve přidejte vnitřní standard a 4 ml destilované vody. Promíchejte/vortexujte a nechte stát 5 minut. Centrifugujte při 670 × g po dobu 10 minut a peletu zlikvidujte. pH supernatantu upravte přidáním pufru.</li><li>Sonikace: Sonikujte 1 ml celé krve po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Přidejte 3–6 ml vhodného pufru (např. fosfátového). Promíchejte/vortexujte, nechte stát 5 minut a centrifugujte při 670 × g po dobu 15 minut. Supernatant analyzujte.</li></ul>Poznámka: Srovnání výše uvedených předúprav bylo provedeno pro kyselé, zásadité i neutrální léčiva. Nejvyšší výtěžnosti byly dosaženy při zředění vzorku pufrem a použití fyzikální denaturace (sonikace) oproti chemickým metodám. Sonikace účinně narušuje buněčné membrány, a pokud je dodržen uvedený protokol, nedochází k ucpávání.<h4>Sliny</h4>U vzorků ústních tekutin není nutná hydrolýza a lze aplikovat obecný protokol používaný pro plazmu/sérum.<h4>Moč</h4>V případě konjugovaných forem analytu (např. sulfátové nebo glukuronidové) je nutná enzymatická hydrolýza. Ta vyžaduje specifické pH (4–5) a teplotu. Lze také použít kyselou nebo zásaditou hydrolýzu v závislosti na stabilitě analytu.<ul><li>Enzymatická hydrolýza: K 500 µl vzorku (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl kyselého pufru (viz níže) a 20 µl β-glukuronidázy. Vortexujte 5–6 sekund, inkubujte ve vodní lázni při 63 °C po dobu 30 minut. Přeneste do 96jamkové destičky nebo vialky pro autosampler, uzavřete a centrifugujte 10 minut při 2 000 ot./min. Příprava kyselého pufru: (1,0 M octanový pufr, pH 4,0): Rozpusťte 3,0 g ledové kyseliny octové a 4,1 g octanu sodného v 1l odměrné baňce.</li><li>Zásaditá hydrolýza: K 1 ml moči (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl 10 N KOH. Promíchejte, vortexujte a nechte hydrolyzovat 20 minut při 60 °C. Ochlaďte a upravte pH na 3,5–4,0 přidáním 200 µl ledové kyseliny octové.</li><li>Kyselá hydrolýza: K 1 ml moči přidejte 0,25 ml HCl do zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Uzávěr volně připevněte a zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni 60 minut. pH následně upravte na 7 (nebo dle potřeby) pomocí 1,0 N NaOH.</li></ul><h4>Tkáň</h4>Homogenizujte s organickým nebo vodným rozpouštědlem v závislosti na rozpustnosti analytu. Nechte usadit, dekantujte, odstřeďte nebo filtrujte supernatant. Na tkáni proveďte přímou extrakci metodou Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD).

Postupy předúpravy vzorků pro bioanalytické analýzy

U většiny aplikací SPE na reverzní fázi využívajících média na bázi oxidu křemičitého (např. <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1507">Strata™ C18-E</a>) se cartridge (nebo jamky v případě 96jamkových destiček) nejprve kondicionují pomocí organického rozpouštědla, jako je methanol, a poté se propláchnou vodou nebo pufrem. Pokud se média SPE na bázi oxidu křemičitého během těchto kondicionačních kroků nechají po delší dobu vyschnout, mohou vykazovat sníženou retenci analytů, zejména pokud jde o polární sloučeniny. Proto je nezbytné, aby uživatelé SPE věnovali během tohoto klíčového kondicionačního kroku velkou pozornost metodice, aby dosáhli přesných a reprodukovatelných výsledků.Níže uvedený obrázek ukazuje dvě cartridge <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1546">Strata C18-T</a> (1 g/6 mL), které byly naplněny 4 mL modrého barviva (CuCl₂). Kartuše vlevo (A) byla nejprve kondicionována 12 mL methanolu, poté byla sušena po dobu deseti minut ve vysokém vakuu (10” Hg) a následně propláchnuta 12 mL vody. Jak je vidět na obrázku, modré barvivo je rovnoměrně rozloženo v celém sorbentním loži. Naproti tomu cartridge na pravé straně (B) byla kondicionována methanolem a bez jakéhokoli sušení okamžitě následovala voda. Za těchto podmínek je modré barvivo viditelné jako úzký, soustředěný pruh na začátku sorbentního lože. Po eluci byla výtěžnost z kartuše B výrazně vyšší než z kartuše A (vysušené kartuše). Tento rozdíl ve výtěžnosti lze připsat především zhoršené retenci barviva v důsledku vysušení sorbentního lože.<h3>Tipy, jak zabránit náhodnému vysušení a ztrátě analytu</h3><ul><li>Nenechte sorbentní lože vyschnout v žádném kroku (pokud to není výslovně uvedeno v metodě).</li><li>Jako alternativu k vakuu použijte gravitační průtok, abyste zabránili přesušení.</li><li>Centrifugujte při nízkých rychlostech (např. 500 ot./min) nebo použijte přetlak.</li><li>Zvažte přechod na ekvivalentní polymerní sorbent, jako je Strata-X, který nevykazuje změny v retenci a výtěžnosti v důsledku periodického vysychání.</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Over_Drying_of_Silica_Based_SPE_Cartridges_Can_Lead_to_Poor_Sample_Recovery_0839e0ef05.jpg" alt="Phenomenex: Vysušení SPE kartuší na bázi siliky může vést k nízké výtěžnosti vzorku: A. Sorbent C18 na bázi siliky vysušený po kondicionaci methanolem; B. Sorbent C18 na bázi siliky kondicionovaný bez vysušení." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Over_Drying_of_Silica_Based_SPE_Cartridges_Can_Lead_to_Poor_Sample_Recovery_0839e0ef05.jpg 245w," sizes="100vw" width="548" height="312">

Vysušení SPE na bázi silikagelu může vést k nízké výtěžnosti vzorku

Souhrnný vliv všech složek vzorku – kromě samotného analytu – na odezvu signálu se nazývá matricový efekt. Komponenty matrice, které koeluují s analyt(y), mohou způsobit zesílení nebo potlačení signálu analytu ve srovnání s hodnotou naměřenou u standardního roztoku analytu (tedy bez přítomnosti matrice). Pokud se matricový efekt nevyhodnotí a/nebo nekoriguje, může mít zásadní dopad na přesnost kvantifikace.Pro stanovení matricového efektu lze provést jednoduchý experiment – porovnat odezvu extrahovaného analytu s odezvou neextrahovaného analytu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Matrix_effect_formula_3b77ff748f.jpg" alt="Phenomenex: Vzorec pro výpočet matricového efektu" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Matrix_effect_formula_3b77ff748f.jpg 245w," sizes="100vw" width="1175" height="134">Nejčastějším přístupem, jak se vyhnout nežádoucím matricovým efektům, je odstranění matrice pomocí technik přípravy vzorku (viz Obrázek 1). Tyto techniky mohou být velmi jednoduché – například filtrace vzorku, precipitace proteinů, extrakce z kapaliny do kapaliny, nebo pokročilejší, jako je extrakce na pevné fázi (SPE) či imunoadsorpční zachycení. Matricový efekt lze v některých případech snížit nebo odstranit také optimalizací LC metody, například pomocí gradientů nebo volbou jiné kolony. Příprava vzorku je však často preferována, protože zároveň prodlouží životnost LC kolony.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_1_Common_sample_preparation_approaches_listed_in_order_of_lower_to_higher_selectivity_61e1f39c43.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 1 – Běžné techniky přípravy vzorku seřazené podle rostoucí selektivity." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_1_Common_sample_preparation_approaches_listed_in_order_of_lower_to_higher_selectivity_61e1f39c43.jpg 220w," sizes="100vw" width="428" height="304">Typickým příkladem matricového efektu je potlačení signálu pozorované při analýze klinických vzorků, jako je krevní plazma nebo sérum, na hmotnostně spektrometrických detektorech. Tyto vzorky obvykle procházejí precipitací proteinů jako nejjednodušším krokem čištění před analýzou. Ten sice pomůže omezit zanášení LC kolony proteiny, ale neodstraní další kontaminanty. Komponenty matrice – zejména fosfolipidy – mohou významně negativně ovlivnit LC analýzy a časem dokonce poškozovat části systému.Na Obrázku 2 je porovnán interferující signál pocházející z fosfolipidů u: (A) séra po pouhé precipitaci proteinů a (B) séra dále vyčištěného extrakcí na pevné fázi pomocí sorbentu Strata™-X PRO.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_2_Phospholipid_traces_obtained_from_human_serum_samples_after_protein_precipitation_7e049e93c4.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 2 – Chromatografy stop fosfolipidů v lidském séru po precipitaci proteinů." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_2_Phospholipid_traces_obtained_from_human_serum_samples_after_protein_precipitation_7e049e93c4.jpg 245w," sizes="100vw" width="677" height="386">Po vyčištění pomocí Strata-X PRO byla pozorována desetinásobná redukce interferujícího signálu z fosfolipidů. Tento polymerní sorbent byl speciálně navržen pro pokročilé odstranění matrice a – jak je vidět výše – účinně odstraňuje fosfolipidy i škodlivé částice ze vzorku, čímž zlepšuje výtěžnost analytů i reprodukovatelnost.Doufáme, že pro vás byl tento tip užitečný! Prohlédněte si náš nástroj a produkty níže.<h4>Strata-X PRO SPE produkty</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/strata-x-pro-solid-phase-extraction-products">Phenomenex: Strata-X PRO SPE</a></li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Strata_X_PRO_SPE_Products_7d659c74c2.jpg" alt="Phenomenex: Strata-X PRO SPE" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Strata_X_PRO_SPE_Products_7d659c74c2.jpg 239w," sizes="100vw" width="387" height="253"><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/tools/spe-method-development">SPE Method Development Tool</a></li></ul>

Tip pro přípravu vzorků – Co je to matricový efekt?

Tento technický tip se zabývá některými problémy, které se mohou vyskytnout při <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">extrakci na pevné fázi </a>(Solid Phase Extraction, SPE), se zvláštním zaměřením na výtěžnost analytu (analyte recovery). Výtěžnost vyjadřuje procento analytu, které je během SPE zachyceno a následně eluováno. Další dva běžně používané pojmy související s výtěžností, které mohou být užitečné, jsou:Relativní výtěžnost (Relative Recovery): Nepřímé stanovení zachycení a eluování analytu během extrakčního procesu na základě výtěžnosti vnitřního standardu (sloučeniny se strukturou podobnou cílovému analytu), který je přidán do surového vzorku/matrice před samotným extrakčním postupem.Absolutní výtěžnost (Absolute Recovery): Kvantitativní metoda pro stanovení skutečného množství analytu zachyceného a eluovaného během extrakčního procesu. Výtěžnost analytu je založena na externím standardu, který je přidán do eluátu na konci extrakčního postupu (na rozdíl od vnitřního standardu, který je extrahován společně s analytem).<h5>Projev</h5><ul><li>Výtěžnost analytu je nižší než 100 %.</li></ul><h5>Indicie</h5><ul><li>Analýza nezadržené frakce (mrtvého objemu, void volume) ukazuje, že analyt je přítomen v průtoku (flow-through).</li></ul><h5>Problém</h5><ul><li>Vazba analytu během kroku nanášení vzorku není kvantitativní.</li></ul><h5>Příčiny / Řešení / Doporučení</h5>A. Kondicionování kolony je nesprávné, chybné nebo není optimalizované:<ol style="list-style-type:decimal;"><li>Kondicionujte kolonu methanolem nebo isopropanolem.</li><li>Použijte dostatečné množství methanolu nebo isopropanolu k úplnému smočení sorbentového lože; nechte protéct více než dva objemy kolony pomalu při nízkém vakuu.</li><li>Bezprostředně po methanolu nebo isopropanolu kolonu promyjte jedním objemem kolony roztokem o složení podobném skutečnému vzorku (s upraveným pH), ale bez analytu(ů).</li><li>Nepoužívejte příliš velké množství tohoto druhého „kondicionačního rozpouštědla“ uvedeného v bodě (3) ani jej nenechávejte v koloně příliš dlouho.</li><li>Nepřesušujte kolonu během ani po kondicionování (použijte nízké vakuum přibližně po dobu 1 minuty).</li></ol>B. Vzorek/matrice je v (nebo obsahuje) rozpouštědle, které je „příliš silné“:<ol><li>Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem/roztokem pro podporu vazby (méně polární pro normální fázi, více polární pro reverzní fázi, nižší obsah solí, pufrované a/nebo s upraveným pH pro iontovou výměnu).</li><li>Zvyšte ředění vzorku „slabým“ rozpouštědlem.</li><li>Nanášejte menší množství vzorku.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Snižte průtok během nanášení vzorku.</li><li>Použijte „silnější“ sorbent s vyšší afinitou k analytu.</li><li>Přidejte organický modifikátor (nebo upravte pH) ke zvýšení afinity analytu(ů) k sorbentu.</li><li>Upravte pH vzorku tak, aby byl analyt neutrální pro reverzní fázi nebo nabitý pro iontovou výměnu.</li><li>Přidejte sůl (5–10 % NaCl) ke zvýšení polarity rozpouštědla a ke zlepšení retence vysoce polárních analytů v reverzní fázi.</li><li>Přidejte ion-párovací činidlo ke zlepšení vazby nabitých analytů v reverzní fázi.</li></ol>C. „Hmotnostní přetížení“ kolony (kolona je příliš malá a/nebo celková hmotnost vázaných složek je příliš vysoká):<ol><li>Snižte objem nanášeného vzorku.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.</li><li>Použijte „silnější“ sorbent.</li><li>Snižte průtok během nanášení (pro zlepšení „difuze“).</li><li>Zmenšete vnitřní průměr kolony při zachování stejné hmotnosti sorbentu (zvýšení tlakové ztráty, snížení průtoku a zlepšení „difuze“).</li><li>Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem pro zvýšení kapacity.</li></ol>D. Průtok je během kroku nanášení vzorku příliš vysoký:<ol><li>Snižte průtok během nanášení.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Zmenšete vnitřní průměr kolony ke snížení průtoku.</li><li>Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.</li></ol>E. Sorbent je „příliš slabý“ (má nízkou afinitu k analytu ve srovnání se vzorkem/matricí a/nebo ředícím rozpouštědlem):<ol><li>Přepněte na „silnější“ sorbent, sorbent s vyšší hustotou ligandů, z non-endcapped na endcapped sorbent (nebo naopak).</li><li>Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu C („Hmotnostní přetížení kolony“).</li><li>Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu B („Vzorek/matrice obsahuje rozpouštědlo, které je příliš silné“).</li></ol>F. Kondicionační rozpouštědlo je „vymýváno“ velkými objemy vzorku:<ol><li>Přidejte 2 % methanolu nebo isopropanolu do vzorku, aby se zabránilo kolapsu alkylových řetězců během kroku nanášení vzorku.</li></ol>

Řešení problémů při SPE

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Shimadzu at ISC 2026

DataApex at ISC 2026

Představení přístroje Revo od společnosti Nicoya

ICP-MS for Hybrid Photoelectrode Characterization

Addressing LC Method Optimization - Scaling For Efficiency, Throughput And Reproducibility

Proteoform Studio software, top down made simple