Všechny <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=51">HPLC kolony Phenomenex</a> jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.<div><div>Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo</li><li>Požadovaná mobilní fáze pro analýzu</li></ul>Je třeba zvážit následující otázky:<ul><li>Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?</li><li>Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:400/247;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp" alt="Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC Columns" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp 245w," sizes="100vw" width="400" height="247"></figure></div></div><div><div>Při práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1</li><li>Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50</li><li>Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony</li><li>Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony</li><li>Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)</li></ul>V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.<ul><li>Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.</li><li>Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).</li></ul></div></div>

Kondicionování/aktivace HPLC kolon

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je kontaminace kolony, která často vede k vysokému zpětnému tlaku a takzvané „ucpané“ vstupní fritě.Tento technický tip si klade za cíl vysvětlit, co se děje, a také jak se lze vyhnout kontaminaci kolony.Při výrobě kolon pro HPLC a UHPLC na bázi částic se frity používají k zabránění vstupu cizího materiálu do kolony a k zabránění tomu, aby náplň z HPLC kolon neunikala. Tyto frity jsou kotouče z porézního kovu, obecně o porozitě 0,5, 1,0 nebo 2,0 µm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, bude odfiltrován z proudu rozpouštědla mobilní fáze, který se nachází na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, dostupný povrch frity pro průchod mobilní fáze se zmenšuje, což omezuje tok mobilní faze a zvyšuje protitlak. Nakonec je téměř nemožné protlačit rozpouštědlo přes fritu a čerpadlo HPLC se vypne.Tomuto procesu lze zabránit filtrací vzorků před nástřikem do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat 0,45 µm porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/phenex-syringe-filters?_gl=1*befa9s*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">stříkačkové filtry </a>pro vzorky, které budou měřeny na 5 µm kolonách, 0,2 µm filtry pro 3 µm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby v ideálním případě rozpouštědlo přidávané ke vzorku odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, můžete se stát, že některé složky vzorku jsou rozpustné v rozpouštědle přidávaného ke vzorku, což jim umožňuje projít filtrem injekční stříkačky.Když jsou vstřikovány do mobilní fáze, mohou se vysrážet a způsobit ucpání frity. Tomu lze předejít buď rozpuštěním vzorku v mobilní fázi, nebo alternativně instalací vstupní frity nebo<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/securityguard-lc-guard-cartridge-system?_gl=1*1bfvfj1*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA.."> guard cartridge</a> jako spotřebního vyvení, aby se zabránilo znečištění vstupu kolony. &nbsp;<blockquote>Případně máme tento <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8337&amp;elqTrackId=7D1B2E6743B19B5717AFAEFF00F8A51C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4836&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5E09C05D0B7BFE5B44C560E3733C27992CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1uyr77*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem ochranné kazety.</blockquote>

Kontaminace kolon – jak k ní dochází a jak se jí lze vyhnout

<h4>HPLC metoda - Proč je to důležité</h4>Následující technika související s metodou navrhuje vylepšení zvyšující výkon při všech separacích. Při použití kolon s core-shell částicemi mohou tyto techniky výrazně zlepšit výkon vaší metody.Metody HPLC by se měly nejprve zaměřit na zaostření vzorku na vstupu kolony a poté minimalizovat disperzi vzorku kolonou. Když minimalizujete rozšíření pásma snížením rozptylu vzorku, zlepšíte citlivost a rozlišení svého píku.&nbsp;Začlenění jednoduchého programování injektoru do metody může minimalizovat extra-column volume, aby se zlepšil tvar píku a účinnost, zejména pro rychlé LC separace.<h4>Problém: Všechny píky jsou široké</h4>1. Zkontrolujte objem nástřiku: Chyby v nasávání vzorků mohou negovat zvýšení výkonu, kterého můžete dosáhnout použitím core-shell částic. Pokud nastřikujete vzorek ve stejném organickém složení jako mobilní fáze za izokratických podmínek, bude počáteční šířka pásma na koloně přímo úměrná objemu nástřiku. Jako takový je do kolony vstřikován velkoobjemový vzorek jako široký pás a poskytuje nízkou účinnost.Řešení: Aby se snížila ztráta účinnosti u velkoobjemových nástřiků, je možné předem koncentrovat vzorek na začátku kolony pomocí slabšího ředícího roztoku než mobilní fáze. Můžete také snížit objem nástřiku. Pokud se používají kolony s vysokou účinností, je pro získání dobré odezvy signálu často zapotřebí menší množství vzorku.&nbsp;2. Zkontrolujte roztok k ředění vzorku: Pokud je organická síla roztoku větší než síla HPLC mobilní fáze, pak se vzorek nanese jako difúzní pás v čele HPLC kolony. K tomu může dojít v izokratických nebo gradientových metodách a může to negovat většinu výkonnostních výhod, které tyto kolony přináší.<ul><li>Gradientní metody, při kterých je vzorek vstřikován v silnějším rozpouštědle než mobilní fáze, vykazuje sloučenina tzv. surfovací účinky, což způsobí, že se píky rozšíří a rozdělí.</li><li>Izokratické metody, kde je rozpouštědlo silnější než mobilní fáze, povedou k nadměrné disperzi vzorku.</li></ul>Řešení: Nastříkněte slabé rozpouštědlo. Nejlepší je použít ředící roztok, který je slabší nebo roven organické síle mobilní fáze, aby se vzorek soustředil na začátku kolony, což by mělo za následek ostřejší píky (tj. vyšší účinnost).<h4>Cíl: Zkrátit čas metody (runtime) a kapacitu píků v gradientových metodách</h4>Zkontrolujte vstřikovací program: Extra-column volume předtím než způsobí disperzi vzorku na cestě do kolony; nástřiková smyčka je hlavním zdrojem extra-column volume.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:464/251;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg 245w," sizes="100vw" width="464" height="251"></figure>Řešení: Během analytické metody (poté, co vzorek opustil injektorovou smyčku) je možné smyčku obejít injektorovým programem. Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je vstřikovací smyčka po injekci obcházena, aby se snížil objem prodlevy systému.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:915/458;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg" alt="Phenomenex: Tabulka 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg 245w," sizes="100vw" width="915" height="458"></figure>

Optimalizace LC systému na UHPLC výkon na jakémkoliv HPLC

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

DataApex at ISC 2026

Představení přístroje Revo od společnosti Nicoya

Waters at ISC 2026

From Legacy Workflows to Paperless Labs: Track Every Sample, Process, and Decision

Informatics series #34 Ready for Self-Documenting Chromatography?

Ask the Expert: What to expect from the new Thermo Scientific™ Orbitrap™ Excedion™ Hybrid mass spectrometers