Všechny <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=51">HPLC kolony Phenomenex</a> jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.<div><div>Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo</li><li>Požadovaná mobilní fáze pro analýzu</li></ul>Je třeba zvážit následující otázky:<ul><li>Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?</li><li>Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:400/247;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp" alt="Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC Columns" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp 245w," sizes="100vw" width="400" height="247"></figure></div></div><div><div>Při práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1</li><li>Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50</li><li>Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony</li><li>Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony</li><li>Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)</li></ul>V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.<ul><li>Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.</li><li>Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).</li></ul></div></div>

Kondicionování/aktivace HPLC kolon

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je kontaminace kolony, která často vede k vysokému zpětnému tlaku a takzvané „ucpané“ vstupní fritě.Tento technický tip si klade za cíl vysvětlit, co se děje, a také jak se lze vyhnout kontaminaci kolony.Při výrobě kolon pro HPLC a UHPLC na bázi částic se frity používají k zabránění vstupu cizího materiálu do kolony a k zabránění tomu, aby náplň z HPLC kolon neunikala. Tyto frity jsou kotouče z porézního kovu, obecně o porozitě 0,5, 1,0 nebo 2,0 µm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, bude odfiltrován z proudu rozpouštědla mobilní fáze, který se nachází na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, dostupný povrch frity pro průchod mobilní fáze se zmenšuje, což omezuje tok mobilní faze a zvyšuje protitlak. Nakonec je téměř nemožné protlačit rozpouštědlo přes fritu a čerpadlo HPLC se vypne.Tomuto procesu lze zabránit filtrací vzorků před nástřikem do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat 0,45 µm porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/phenex-syringe-filters?_gl=1*befa9s*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">stříkačkové filtry </a>pro vzorky, které budou měřeny na 5 µm kolonách, 0,2 µm filtry pro 3 µm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby v ideálním případě rozpouštědlo přidávané ke vzorku odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, můžete se stát, že některé složky vzorku jsou rozpustné v rozpouštědle přidávaného ke vzorku, což jim umožňuje projít filtrem injekční stříkačky.Když jsou vstřikovány do mobilní fáze, mohou se vysrážet a způsobit ucpání frity. Tomu lze předejít buď rozpuštěním vzorku v mobilní fázi, nebo alternativně instalací vstupní frity nebo<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/securityguard-lc-guard-cartridge-system?_gl=1*1bfvfj1*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA.."> guard cartridge</a> jako spotřebního vyvení, aby se zabránilo znečištění vstupu kolony. &nbsp;<blockquote>Případně máme tento <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8337&amp;elqTrackId=7D1B2E6743B19B5717AFAEFF00F8A51C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4836&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5E09C05D0B7BFE5B44C560E3733C27992CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1uyr77*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem ochranné kazety.</blockquote>

Kontaminace kolon – jak k ní dochází a jak se jí lze vyhnout

<h4>HPLC metoda - Proč je to důležité</h4>Následující technika související s metodou navrhuje vylepšení zvyšující výkon při všech separacích. Při použití kolon s core-shell částicemi mohou tyto techniky výrazně zlepšit výkon vaší metody.Metody HPLC by se měly nejprve zaměřit na zaostření vzorku na vstupu kolony a poté minimalizovat disperzi vzorku kolonou. Když minimalizujete rozšíření pásma snížením rozptylu vzorku, zlepšíte citlivost a rozlišení svého píku.&nbsp;Začlenění jednoduchého programování injektoru do metody může minimalizovat extra-column volume, aby se zlepšil tvar píku a účinnost, zejména pro rychlé LC separace.<h4>Problém: Všechny píky jsou široké</h4>1. Zkontrolujte objem nástřiku: Chyby v nasávání vzorků mohou negovat zvýšení výkonu, kterého můžete dosáhnout použitím core-shell částic. Pokud nastřikujete vzorek ve stejném organickém složení jako mobilní fáze za izokratických podmínek, bude počáteční šířka pásma na koloně přímo úměrná objemu nástřiku. Jako takový je do kolony vstřikován velkoobjemový vzorek jako široký pás a poskytuje nízkou účinnost.Řešení: Aby se snížila ztráta účinnosti u velkoobjemových nástřiků, je možné předem koncentrovat vzorek na začátku kolony pomocí slabšího ředícího roztoku než mobilní fáze. Můžete také snížit objem nástřiku. Pokud se používají kolony s vysokou účinností, je pro získání dobré odezvy signálu často zapotřebí menší množství vzorku.&nbsp;2. Zkontrolujte roztok k ředění vzorku: Pokud je organická síla roztoku větší než síla HPLC mobilní fáze, pak se vzorek nanese jako difúzní pás v čele HPLC kolony. K tomu může dojít v izokratických nebo gradientových metodách a může to negovat většinu výkonnostních výhod, které tyto kolony přináší.<ul><li>Gradientní metody, při kterých je vzorek vstřikován v silnějším rozpouštědle než mobilní fáze, vykazuje sloučenina tzv. surfovací účinky, což způsobí, že se píky rozšíří a rozdělí.</li><li>Izokratické metody, kde je rozpouštědlo silnější než mobilní fáze, povedou k nadměrné disperzi vzorku.</li></ul>Řešení: Nastříkněte slabé rozpouštědlo. Nejlepší je použít ředící roztok, který je slabší nebo roven organické síle mobilní fáze, aby se vzorek soustředil na začátku kolony, což by mělo za následek ostřejší píky (tj. vyšší účinnost).<h4>Cíl: Zkrátit čas metody (runtime) a kapacitu píků v gradientových metodách</h4>Zkontrolujte vstřikovací program: Extra-column volume předtím než způsobí disperzi vzorku na cestě do kolony; nástřiková smyčka je hlavním zdrojem extra-column volume.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:464/251;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg 245w," sizes="100vw" width="464" height="251"></figure>Řešení: Během analytické metody (poté, co vzorek opustil injektorovou smyčku) je možné smyčku obejít injektorovým programem. Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je vstřikovací smyčka po injekci obcházena, aby se snížil objem prodlevy systému.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:915/458;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg" alt="Phenomenex: Tabulka 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg 245w," sizes="100vw" width="915" height="458"></figure>

Optimalizace LC systému na UHPLC výkon na jakémkoliv HPLC

Gradientová eluce v HPLC je skvělým nástrojem pro analýzu vzorků, jejichž analyty vykazují široké rozpětí retenčních sil na stacionární fázi zvolené chromatografické kolony. Gradienty však nemusí být vždy ideální z hlediska použití pufrů, zejména pokud se snažíme udržet specifickou hodnotu pH. Pokud je pufr omezen pouze na vodnou mobilní fázi a organická mobilní fáze zůstává čistým organickým rozpouštědlem, může gradient narážet na omezení v rozpustnosti a kolísání pufrační kapacity s rostoucím podílem organické fáze během průběhu gradientu. Tuto nevýhodu lze překonat rovnoměrným rozdělením pufru do obou mobilních fází („slabé“ i „silné“), jak si dále ukážeme na přístupech a příkladech.&nbsp;Co třeba přidat do obou mobilních fází kyselé nebo zásadité aditivum, například 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí (HCO₂H)?&nbsp;Takový přídavek do obou fází může pomoci udržet konzistentní koncentraci aditiva v celkové mobilní fázi během změny poměru mezi „slabou“ a „silnou“ mobilní fází. Nevýhodou tohoto přístupu je však volatilita aditiva, která může způsobit nestabilní protonaci či deprotonaci analytů. A někteří z nás si jistě přiznají, že ne vždy připravujeme (v/v) přídavky zcela přesně. Alternativně lze použít vhodný pufr s odpovídající solí pro konkrétní aditivum, který udrží stálé pH, při kterém je připraven, bez rizika odpařování aditiva.Pufry na bázi mravenčanu amonného (NH₄HCO₂) nebo acetátu amonného (NH₄CH₃CO₂) jsou pro gradientovou eluci nejvhodnější, protože jsou dobře rozpustné v methanolu, zatímco jejich vodné pufry lze mísit i s vysokými poměry acetonitrilu. Potřebná pufrační kapacita bývá zpravidla 5–10 mM v každé fázi. Pro srovnání: při izokratické eluci s mobilní fází 60:40 (20 mM pufr:acetonitril) je výsledná koncentrace pufru pouze 12 mM. Obr. 1 znázorňuje analýzu mykotoxinů na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex™ Bifenyl</a> s 5 mM pufrem acetátu amonného obsaženým ve vodné i methanolové fázi – acetát amonný byl přímo rozpuštěn v methanolu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 1 – Analýza mykotoxinů na Kinetex Biphenyl (ID aplikace 21951)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg 245w," sizes="100vw" width="904" height="475">Při použití acetonitrilu je třeba jej míchat s vodným pufrem, aby byla zachována rozpustnost pufrovací soli. &nbsp;Obr. 2 znázorňuje HILIC analýzu nederivatizovaných aminokyselin na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1542">Biozen™ Glycan</a>, kde byl zásobní pufr (100 mM mravenčan amonný, pH 3,1) přidán do vody i do acetonitrilu v poměru 9:1 (rozpouštědlo:pufr). Výsledná koncentrace pufru v obou fázích byla 10 mM, což udrželo konzistentní pufrační sílu v průběhu gradientu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 2 – Nederivatizované aminokyseliny na bioZen Glycan (technická poznámka 1264)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg 245w," sizes="100vw" width="987" height="486">Fluorid amonný (NH₄F) se často přidává v malém množství (0,1–0,2 mM) do mobilní fáze pro dosažení vysoce citlivých fluoridových aduktů [M+F]⁻ v režimu ESI⁻ nebo pro podporu tvorby iontů [M+H]⁺ nebo [M+NH₄]⁺ v ESI⁺ režimu. Obr. 3 znázorňuje použití třetího rozpouštědlového kanálu, kterým je 1 mM NH₄F dodáván v konstantním poměru 10 % do celkové mobilní fáze, čímž je zajištěna stálá koncentrace 0,1 mM v celém gradientu. Tato metoda je umožněna ternárními nebo kvarterními pumpami, přičemž se doporučuje izokratické zdržení na začátku metody kvůli lepší přenositelnosti metody mezi různými přístroji. Takové gradienty jsou totiž ovlivněny tzv. „dwell volume“, specifickým pro každý HPLC systém, a to i tehdy, pokud je jedno z rozpouštědel dávkováno konstantně.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 3 – Mikrocystiny na Luna Omega Polar C18 (ID aplikace 23568)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1071" height="550">Dejte si pozor na rozpustnost pufrů, pokud chcete do gradientu zařadit pufry jako hydrogenuhličitan amonný nebo fosfátové pufry, zejména právě fosfátové. Při vyšším obsahu organického rozpouštědla může dojít k precipitaci a doporučuje se nejprve provést studii rozpustnosti. A nakonec – nezapomeňte zahrnout použitý pufr také do ředicího roztoku vzorku, aby bylo pH sladěno s mobilní fází. To zlepší tvar píků i reprodukovatelnost. Gradientová eluce, u níž je udržována konstantní pufrační síla a hodnota pH, významně zvyšuje spolehlivost HPLC metody.

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Polární oblasti se stávají přístupnějšími a popularita polární turistiky roste. Zatímco se zvyšuje provoz výletních lodí, stoupá také množství vypouštěných odpadních vod do některých z nejkřehčích ekosystémů na Zemi. Nová studie provedená centrem RECETOX ve spolupráci s Norským institutem pro výzkum vody (NIVA) a expediční společností HX (dříve známou jako Hurtigruten Expeditions) analyzovala čištěné odpadní vody ze tří expedičních výletních lodí, v nichž bylo nalezeno více než 160 chemických sloučenin, včetně farmaceutik, produktů osobní péče a průmyslových chemikálií.„Námořní doprava roste alarmujícím tempem. Turistika na výletních lodích je nejrychleji se rozvíjejícím odvětvím v turistickém sektoru, lodě se zvětšují a některé pojmou více než 6000 pasažérů. Využívání ostatních typů lodní dopravy, jako jsou ropné tankery nebo kontejnerové lodě, také narůstá. I přesto však víme jen velmi málo o typech a množství chemikálií uvolňovaných prostřednictvím vypouštění odpadních vod. Spoléhat se na starý předpoklad, že oceán může zředit všechny znečišťující látky, už ale není bezpečné,“ říká hlavní autorka studie Veronica van der Schyff.Výzkumníci zkoumali čištěné odpadní vody ze tří expedičních výletních lodí různého stáří a stavu renovace. Voda byla kombinací šedé vody (voda z lodních sprch a kuchyní) a černé vody (kanalizace), která již byla ošetřena v palubní čistírně odpadních vod a byla připravena k vypuštění. Lodě vypouštějí čištěné odpadní vody tři námořní míle (NM) od pobřeží a mohou vypouštět neošetřenou vodu 12 NM a více od pobřeží.„Studie zjistila přítomnost antibiotik v odpadních vodách, což vyvolává obavy z šíření antibiotické rezistence a potenciálního narušení mořského života. Byly nalezeny také další léky, jako jsou kardiovaskulární léky nebo antidepresiva. Tyto sloučeniny nejsou snadno odstranitelné čistírnami odpadních vod a jsou uvolňovány do okolního oceánu, kde mohou být transportovány ještě dále, což může potenciálně ovlivnit místní divokou přírodu,“ vysvětluje Veronica van der Schyff.Studie zdůrazňuje naléhavou potřebu silnější legislativy pro čištění a vypouštění odpadních vod v polárních oblastech, nutnost cíleného monitorování perzistentních kontaminantů a přehodnocení současných standardů pro čištění odpadních vod v námořní dopravě.Ačkoli jsou lodě anonymizovány, výzkumný tým děkuje inženýrům, posádce a expedičním týmům všech lodí za jejich podporu a spolupráci.<blockquote><h4>Původní článek</h4><h4><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.estlett.5c00209">Occurrence of Pharmaceuticals and Other Anthropogenic Compounds in the Wastewater Effluent of Arctic Expedition Cruise Ships</a></h4>Veronica van der Schyff, Marek Stiborek, Zdeněk Šimek, Branislav Vrana, Verena Meraldi, Andrew Luke King, Lisa MelymukEnviron. Sci. Technol. Lett. 2025, 12, 5, 648–654<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://doi.org/10.1021/acs.estlett.5c00209">https://doi.org/10.1021/acs.estlett.5c00209</a><h6>licensed under <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/">CC-BY 4.0</a></h6></blockquote>Následuje vybraná část z textu. Formát a hypertextové odkazy byly převzaty z originálu.<h4>Metody a materiály</h4><h5>Popis lodí</h5>Vzorky odpadních vod byly odebrány ze tří výletních lodí s různou dobou provozu a různými provozními podmínkami. Loď 1 (spuštěna na vodu v roce 2002, renovována v roce 2020, 530 cestujících, 16 000 hrubé tuny (GT)), loď 2 (spuštěna na vodu v roce 2003, 570 cestujících, 16 000 GT) a loď 3 (spuštěna na vodu v roce 2020, 530 cestujících, 21 000 GT) všechny často operují v severním Atlantickém oceánu a často plují nad polárním kruhem (66°30′ s. š.). Demografické složení cestujících na všech třech lodích během vzorkovacích plaveb tvořili převážně důchodci.Lodě 1 a 3 jsou vybaveny pokročilým systémem čištění odpadních vod (AWP), který kombinuje biologické čištění, vícestupňovou filtraci a zpracování kalu pro účinné čištění černé a šedé vody. Systém WWTS na palubě lodi 1 byl dodatečně instalován během renovace, zatímco na lodi 3 byl zabudován již při stavbě. Loď 2 používá fyzikálně-chemický systém čištění odpadních vod založený na vzduchové flotaci, chemické koagulaci a UV dezinfekci. Systém je primárně navržen pro čištění černé vody, ale může fungovat i se směsí černé a šedé vody.<h5>Odběr vzorků</h5>Odběr vzorků se prováděl jednou, když byla každá loď na moři, krátce před vypuštěním odpadních vod &gt;3 NM od pobřeží, aby bylo zajištěno, že odebrané vzorky reprezentují běžné provozní podmínky. Z konečné akumulační nádrže každé lodi byly odebrány dva litry odpadní vody v polykarbonátových lahvích Nalgene, které obsahovaly směs upravené černé a šedé vody připravené k vypouštění na moře. Vzorky byly poté filtrovány přes předem upravené disky AttractSPE Disks HLB (Affinisep, Francie, Hydrophilic/Lipophilic Balanced; <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acs.estlett.5c00209/suppl_file/ez5c00209_si_001.pdf">doplňující informace</a>) v alikvotních částech o objemu 100–150 ml na palubě. Ačkoli se objemy alikvotních částí lišily, nejedná se o omezení, protože studie se zaměřila spíše na kvalitativní screening podezřelých látek než na kvantitativní měření koncentrací. Po filtraci byly vzorky vysušeny mírným podtlakem, skladovány v chladu při teplotě 4 °C v lodní laboratoři po dobu 7 dnů, přepraveny do laboratoře v České republice v chladicích taškách s chladícími vložkami a následně zmraženy při teplotě −20 °C pro skladování v laboratoři RECETOX v České republice až do extrakce.<h5>Extrakce a čištění vzorků</h5>Bezprostředně před zpracováním vzorků byly disky HLB přeneseny do mrazáku o teplotě −80 °C v rámci přípravy na lyofilizaci a následně lyofilizovány. K izolaci analytů byl použit extrakční protokol upravený podle Moschet et al. <a href="javascript:void(0);">(27)</a>. Disky byly podrobeny postupné extrakci acetonem a methanolem, poté byly kombinované frakce rozpouštědla koncentrovány na 1 ml pomocí mírného proudu dusíku. Konečný extrakt byl filtrován a připraven k analýze pomocí kapalinové chromatografie spojené s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (LC-HRMS). Podrobný popis je uveden v <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acs.estlett.5c00209/suppl_file/ez5c00209_si_001.pdf">doplňujících informacích</a>.<h5>Analýzy LC-HRMS a zpracování dat</h5>Stručně řečeno, pro kvalitativní analýzy extraktů z odpadních vod byla použita vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie. Byly analyzovány dvě alikvótní části z každé lodi. Chromatografická separace byla provedena pomocí systému <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/154">Agilent 1290 Infinity LC</a> (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) vybaveného kolonou <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex Core–Shell Biphenyl </a>(150 mm × 2,1 mm, velikost částic 1,7 μm) a předkolonou (Phenomenex, Torrance, CA). Detekce hmotnostní spektrometrií byla provedena pomocí systému <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/166">Agilent 6550 Q-TOF iFunnel</a> pracujícího v režimech pozitivní a negativní elektrosprejové ionizace (ESI). Bylo použito iterativní datově závislé snímání (DDA) MS/MS spekter s maximálně čtyřmi fragmentovanými prekurzorovými ionty na cyklus při kolizních energiích 10, 20 a 40 eV. Podrobný popis analytické metody je uveden v <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acs.estlett.5c00209/suppl_file/ez5c00209_si_001.pdf">doplňujících informacích</a>.Kombinované soubory surových dat z úplného skenování a MS/MS byly zpracovány pomocí softwaru <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/23">Agilent MassHunter Qualitative Analysis Software 10.0</a> (Agilent Technologies). Zpracování dat zahrnovalo výběr píků, přiřazení molekulárních vzorců, hodnocení izotopových vzorců a identifikaci nalezených znaků na základě shody s předpokládaným molekulárním vzorcem a MS/MS spektry přítomnými v knihovnách hmotnostních spekter. Úplný seznam použitých databází a zajištění kvality je uveden v <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.estlett.5c00209#notes1">doplňkových informacích</a>. Všechny zde uvedené sloučeniny byly identifikovány s úrovní spolehlivosti 1 nebo 2 podle Schymanskiho úrovní spolehlivosti identifikace (SL1, potvrzeno referenčním standardem, nebo SL2, pravděpodobná struktura; shoda s knihovnou nebo diagnostický důkaz) v analýze pomocí vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie. <a href="javascript:void(0);">(28)</a>

Studie upozorňuje na rizika vypouštění odpadních vod z výletních lodí v polárních vodách

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

V tomto technickém tipu se zaměříme na běžný problém asymetrie píku (tzv. tailing), který se objevuje při analýze bazických sloučenin na silikagelu typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.<h4>Úvod:</h4>První kolony pro chromatografii na reverzní fázi byly založeny na silikagelu typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly, že silanolové skupiny na povrchu siliky vykazovaly zvýšenou a proměnlivou aktivitu. Výrobci se snažili tyto skupiny co nejvíce deaktivovat (endcappingem) po navázání C18 ligandů, aby omezili místa, kde může docházet k iontové výměně. Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování. Podívejme se, jak lze toto omezení překonat.<h4>Strategie pro zlepšení tvaru píku:</h4><ul><li>Práce při nízkém pH pomáhá neutralizovat silanolové skupiny na povrchu siliky a zabránit tak iontové výměně. Pro tento účel je vhodný 10–20mM fosfátový pufr o pH 2,5. Při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla je však třeba dbát opatrnosti, aby nedošlo k vysrážení pufru při gradientové eluci.</li><li>Přidání konkurenční báze (tzv. silanolového supresoru) do mobilní fáze. Nejčastěji se používá TEA (triethylamin) v koncentraci 5 mM. Tento přístup funguje na principu, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, čímž snižuje jejich dostupnost pro interakce s analyty. Ačkoli je tato strategie účinná, může zkracovat životnost kolony, protože silanolové supresory urychlují hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu, což následně zvyšuje expozici siliky a vede k zhoršení tvaru píku.</li></ul>Tyto strategie mohou výrazně omezit chvostování píků, ale nemusí jej zcela eliminovat, jak ukazují chromatogramy na obrázcích A a B.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg" alt="Phenomenex: Omezení tailingu bázických analytů při chromatografii na stacionární fázi ze silikagelu typu A v reverzní fázi: A) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 2,5 : methanol (70:30), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 254 nm; B) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 3 s 400 µL/L triethylaminu : acetonitril (63:37), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 230 nm." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg 245w," sizes="100vw" width="939" height="332">Obrázek A ukazuje, jak kyselé pH mírně zlepšuje tvar píku benzylaminu, zatímco obrázek B zachycuje výraznější zlepšení po přidání triethylaminu jako modifikátoru.<blockquote>Při vývoji nových separačních metod doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Plně porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=omega">kolony Luna™ Omega</a> i kolony <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=339&amp;manufacturerItems=50&amp;search=kinetex+">Kinetex™ Core-Shell</a> poskytují vynikající tvar píků i u náročných bazických analytů.</blockquote>

Omezení chvostujících píků bazických analytů při chromatografii na reverzní fázi se silikagelovou stacionární fází typu A

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Centrum je samostatným ústavem Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity, který realizuje výzkum, vývoj, výuku a expertní činnost v oblasti znečištění prostředí toxickými látkami. Předmětem zájmu jsou především perzistentní organické polutanty (POPs), polární organické látky, toxické kovy a jejich specie, přírodní toxiny (cyanotoxiny).

RECETOX - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Shimadzu at ISC 2026

DataApex at ISC 2026

Waters at ISC 2026

Managing 4D-STEM data with smarter acquisition

Spatial Proteomics for Translational Research

Streamlining Endotoxin Testing: Automated Sample Preparation and Audit-Ready Workflows for QC Laboratories