Extrakce kapalinou pod tlakem: princip, metoda a pracovní postup

Extrakce kapalinou pod tlakem (pressurized liquid extraction, PLE) je zavedená technika přípravy vzorků určená k extrakci cílových analytů z pevných a polotuhých matric před chromatografickou analýzou (1). Laboratoře zabývající se analýzou půd, komplexních potravinových matric, biologických vzorků a nutraceutik využívají PLE k přípravě vzorků v souladu s cíli zelené analytické chemie a zároveň k získávání konzistentních extraktů pro následné HPLC a GC analýzy při zpracování velkého počtu vzorků (1–3).

Tento článek podrobně popisuje princip PLE, používané přístrojové vybavení, postup extrakce krok za krokem a parametry, které ovlivňují její úspěšnost.

Co je PLE?

PLE je extrakční metoda, při níž se analyty z pevných nebo polotuhých vzorků extrahují rozpouštědlem za zvýšené teploty a tlaku. Tyto podmínky zvyšují účinnost extrakce a zároveň udržují rozpouštědlo v kapalném stavu (2, 4). V praxi PLE využívá zvýšenou teplotu v kombinaci s řízeným tlakem, díky čemuž rozpouštědlo zůstává kapalné, lépe proniká do pórů vzorku a urychluje přenos analytů z matrice do rozpouštědla. Účinné extrakce tak lze dosáhnout během několika minut namísto hodin (1, 2).

PLE je obecné označení této techniky. V odborné literatuře se používají také související termíny PFE (Pressurized Fluid Extraction) a PSE (Pressurized Solvent Extraction), zatímco označení ASE (Accelerated Solvent Extraction) se široce využívá v souvislosti s přístroji a metodami. Tyto termíny označují úzce související postupy založené na extrakci rozpouštědlem při zvýšené teplotě a tlaku. Použité názvosloví by však mělo vycházet z terminologie příslušné metody, dokumentace k přístroji a relevantních regulačních dokumentů (4, 5).

PLE se začala používat v polovině 90. let 20. století s cílem zkrátit dobu extrakce a snížit spotřebu rozpouštědel ve srovnání s tradičními postupy. Dnes se běžně využívá v oblasti bezpečnosti potravin, v environmentální analýze a v dalších analytických pracovních postupech, v nichž převažují pevné a polotuhé vzorky (1–3, 6).

Proč je PLE důležitá při přípravě vzorků?

Příprava vzorků často určuje, kolik vzorků lze reálně zpracovat a jak spolehlivý je celý analytický pracovní postup, a právě v tomto ohledu PLE vyniká (1–3). Ve srovnání s mnoha konvenčními metodami extrakce pevná látka–kapalina zkracuje dobu extrakce a snižuje spotřebu rozpouštědel, přičemž zachovává nebo zvyšuje výtěžnost extrakce různých analytů (1, 3, 7). Výsledkem jsou nižší náklady na rozpouštědla, menší nároky na manipulaci s laboratorním sklem a environmentální profil odpovídající současným požadavkům zelené analytické chemie (3, 7).

PLE také umožňuje automatizaci a zpracování více vzorků, což je výhodné pro laboratoře, které již využívají automatizované techniky přípravy vzorků, jako jsou QuEChERS, SLE (supported liquid extraction) nebo klasická extrakce kapalina-kapalina, před následnou LC nebo GC analýzou (1, 2). V oblasti environmentální analýzy popisuje metoda EPA 3545A použití PFE k extrakci ve vodě nerozpustných nebo málo rozpustných organických sloučenin z půd, jílů, sedimentů, kalů a pevných odpadů. Metoda 3545A tak představuje relevantní referenční postup pro příslušné environmentální aplikace, její použití však nelze automaticky vztahovat na všechny aplikace PLE (4, 5).

Princip PLE

Princip PLE spočívá ve zlepšení přístupu extrakčního rozpouštědla k analytům v pevné nebo polotuhé matrici kombinací zvýšené teploty s dostatečným tlakem, který udržuje rozpouštědlo v kapalném stavu. Teplota má obecně nejvýraznější vliv na kinetiku extrakce: zvyšuje rozpustnost analytů, snižuje viskozitu rozpouštědla a urychluje difúzi. Tlak slouží především k udržení rozpouštědla v kapalném stavu a pomáhá zajistit rovnoměrný kontakt rozpouštědla se vzorkem v extrakční cele (1, 2).

Typické metody PLE využívají zvýšenou teplotu a tlak dostatečný k tomu, aby rozpouštědlo zůstalo během extrakce v kapalném stavu. Přesné podmínky je nutné volit podle vlastností rozpouštědla, typu matrice, stability analytu a limitů přístroje (1). Takové podmínky umožňují udržet rozpouštědlo v kapalné fázi i při teplotách nad jeho normálním bodem varu, podporují jeho pronikání do zhutněné náplně extrakční cely a zvyšují rozpustnost analytů i rychlost jejich difúze (1, 2).

Tyto parametry se nastavují tak, aby bylo dosaženo vhodné rovnováhy mezi účinností extrakce, stabilitou analytu a chováním matrice. Při vývoji metody je proto nutné sledovat vzájemné působení teploty, tlaku, složení rozpouštědla a doby extrakce (1, 2, 6).

Vliv zvýšené teploty

Zvýšená teplota zvyšuje rozpustnost analytu ve zvoleném rozpouštědle, snižuje viskozitu rozpouštědla a urychluje difúzi do pevné matrice i z ní. Extrakce proto probíhá rychleji než při běžné teplotě (1–3).

Při PLE se těchto výhod dosahuje, zatímco rozpouštědlo zůstává v kapalném stavu, a zachovávají se tak obvyklé interakce mezi rozpouštědlem a analytem důležité pro následnou LC nebo GC analýzu (1, 2). Použití vyšší teploty je však nutné pečlivě posoudit, protože termolabilní analyty se mohou za intenzivních extrakčních podmínek rozkládat, hydrolyzovat, oxidovat, izomerizovat nebo jinak interagovat se složkami matrice (3).

Vliv zvýšeného tlaku

Tlak při PLE slouží především k udržení rozpouštědla v kapalném stavu při zvýšené teplotě a usnadňuje jeho pronikání do pórů vzorku (1, 2). Tlak v rozmezí 10–20 MPa udržuje rozpouštědlo v extrakční cele v kapalném stavu a omezuje tvorbu bublin a nerovnoměrné proudění rozpouštědla vzorkem, které by jinak narušovalo přenos analytů mezi matricí a rozpouštědlem (1).

Tlak také pomáhá udržovat rovnoměrný kontakt rozpouštědla se vzorkem v extrakční cele a snižuje riziko tvorby par při zvýšené teplotě. Jakmile rozpouštědlo zůstává v kapalném stavu, ovlivňují účinnost extrakce obvykle výrazněji složení rozpouštědla, teplota, struktura matrice a doba extrakce než samotný tlak (1, 2).

Synergický efekt na účinnost extrakce

Při současném působení zvýšené teploty a tlaku se mění důležité fyzikálně-chemické vlastnosti rozpouštědla, včetně jeho viskozity, difuzivity a solvatační schopnosti. Výsledkem je rychlejší a úplnější extrakce analytů z pevných matric (1–3).

Díky tomuto synergickému efektu lze pomocí PLE dosáhnout vysoké výtěžnosti extrakce při relativně krátké době statické fáze a menším počtu extrakčních cyklů než u řady tradičních metod. Přitom se používají běžná kapalná rozpouštědla známá z chromatografických pracovních postupů (1, 3, 7).

Zařízení a přístrojové vybavení pro PLE

Systémy PLE využívají průtokovou extrakční celu propojenou s čerpadlem, pecí, prvky pro regulaci tlaku, sběrnými nádobami a systémem profouknutí. Konstrukční řešení jednotlivých přístrojů se však může lišit (2, 8).

Kromě samotného přístrojového vybavení ovlivňuje výsledky PLE řada parametrů metody, mezi které patří objem extrakční cely, hmotnost vzorku, typ rozpouštědla, teplota, tlak, doba statické fáze, počet cyklů, objem proplachu, doba profouknutí systému a následné zpracování extraktu. Tyto parametry je důležité dokumentovat, protože ovlivňují výtěžnost, reprodukovatelnost, koextrakci složek matrice a přenositelnost metody.

Tato konfigurace umožňuje analytikům pro každou metodu nastavit typ rozpouštědla, teplotu, tlak, dobu statické fáze, počet cyklů a objem proplachu a přizpůsobit tak přípravu vzorku požadavkům navazující LC nebo GC analýzy (1, 2, 6).

Extrakční cela z nerezové oceli

Extrakční cela je základní součástí systému. Obvykle jde o nádobu z nerezové oceli nebo jiného vysoce odolného kovu, která je navržena tak, aby odolávala zvýšené teplotě a tlaku a zároveň pojala vzorek, filtry, dispergační materiály, sušidla nebo sorbenty pro přečištění (2, 8). Pevné nebo polotuhé vzorky se podle potřeby smísí s dispergačním materiálem nebo sušidlem a poté se naplní do extrakční cely. Cela se uzavře a umístí do pece, kde probíhá řízený ohřev (2, 6, 8).

Čerpadlo pro přívod rozpouštědla

Vysokotlaké čerpadlo přivádí zvolené rozpouštědlo ze zásobníku do extrakční cely, čímž zvyšuje tlak v systému na cílovou hodnotu, zatímco pec ohřívá celu na nastavenou teplotu (2, 8). Tento krok určuje objem rozpouštědla v extrakční cele během statické fáze a pomáhá nastavit poměr vzorku k rozpouštědlu, který u mnoha analytů významně ovlivňuje výtěžnost extrakce (2, 6).

Pec

V peci je umístěna extrakční cela a během extrakčního cyklu je řízen její teplotní profil. Rozpouštědlo i matrice jsou během fáze statické extrakce udržovány na nastavené teplotě (1, 2, 8). Řízení teploty v peci je zásadní pro robustnost a reprodukovatelnost metody, protože teplota ovlivňuje kinetiku extrakce a stabilitu analytů (1–3).

Regulátor tlaku a omezovač průtoku

Regulátory tlaku a omezovače průtoku udržují systém na cílovém tlaku a řídí průtok rozpouštědla extrakční celou a z ní (2, 8). Stabilní tlak zabraňuje tvorbě par a pomáhá udržovat rovnoměrný kontakt rozpouštědla se vzorkem v extrakční cele, což je zvláště důležité u metod s více extrakčními cykly pro komplexní matrice (1, 2).

Sběrné nádobky a systém profouknutí inertním plynem

Po extrakci je extrakt odváděn do sběrných nádob a před chromatografickou analýzou se obvykle posoudí, zda vyžaduje další úpravu. V závislosti na složitosti matrice a požadavcích na detekci může být před analýzou pomocí HPLC, UHPLC, LC-MS/MS, GC nebo GC-MS nutná filtrace, centrifugace, ředění, odpaření a rekonstituce, výměna rozpouštědla, SPE, disperzivní SPE, SLE, čištění typu QuEChERS nebo jiné techniky přípravy vzorků (1, 2, 6).

Mnoho systémů PLE využívá na konci extrakce profouknutí inertním plynem, nejčastěji dusíkem. Plyn vytlačí zbytkové rozpouštědlo z extrakční cely a vedení, čímž zajistí jeho účinnější odstranění a připraví systém na další vzorek (2, 8).

Postup PLE krok za krokem

Vlastní PLE probíhá v několika standardních krocích, které lze přizpůsobit konkrétní matrici a analytům při zachování základního principu této techniky. Vývoj metody PLE se soustředí právě na optimalizaci tohoto pracovního postupu tak, aby PLE dobře navazovala na další techniky přípravy vzorků a chromatografickou analýzu (1, 2, 6).

Krok 1: Předúprava a sušení vzorku

Pevné nebo polotuhé vzorky se nejprve homogenizují, v případě potřeby rozemelou a vysuší nebo smísí se sušidlem, pokud je nutné kontrolovat obsah vlhkosti. Vlhkost může měnit extrakční vlastnosti rozpouštědla, ovlivňovat bobtnání matrice, zhoršovat reprodukovatelnost extrakce a způsobovat kolísání průtoku nebo tlaku v extrakční cele (2, 6).  Vzorek se často mísí s inertním dispergačním materiálem nebo sušidlem, aby bylo možné celu rovnoměrně naplnit a zajistit dobrý přístup rozpouštědla k povrchu částic vzorku během extrakce (2, 3, 6).

Krok 2: Naplnění extrakční cely

Upravená směs vzorku se naplní do extrakční cely z nerezové oceli, která je na obou koncích opatřena fritami nebo filtry. Ty zadržují pevné částice a zároveň umožňují průtok rozpouštědla (2, 8).

Rovnoměrné naplnění extrakční cely pomáhá předcházet vzniku dutin, nerovnoměrnému proudění rozpouštědla vzorkem, nadměrnému protitlaku a nerovnoměrnému kontaktu vzorku s rozpouštědlem. Způsob plnění cely by měl být při vývoji metody standardizován, protože rozdíly v naplnění mohou přímo ovlivnit výtěžnost a opakovatelnost extrakce (3, 5, 7).

Krok 3: Výběr rozpouštědla a naplnění cely

Výběr rozpouštědla by měl vycházet z polarity analytu, složení matrice, stability analytu, požadované selektivity extrakce a kompatibility s následnou chromatografickou metodou. Pro LC-MS/MS se upřednostňují těkavá rozpouštědla s nízkým obsahem reziduí. U GC nebo GC-MS může být před nástřikem nutná výměna rozpouštědla, zakoncentrování nebo další čištění extraktu (2, 3). Čerpadlo naplní extrakční celu zvoleným rozpouštědlem tak, aby bylo dosaženo požadovaného objemu a poměru vzorku k rozpouštědlu, čímž se nastaví počáteční podmínky pro fázi statické extrakce (2, 6).

Krok 4: Ohřev a natlakování

Po naplnění cely vzorkem a rozpouštědlem se cela v peci zahřeje na nastavenou teplotu a současně se systém natlakuje na cílovou hodnotu, čímž se vytvoří základní podmínky PLE (1, 2). Tyto podmínky zajišťují během ohřevu stálý kontakt rozpouštědla se vzorkem v extrakční cele, což je nezbytné pro reprodukovatelný průběh extrakce (1, 2).

Krok 5: Fáze statické extrakce

Během fáze statické extrakce zůstává rozpouštědlo po stanovenou dobu v kontaktu se vzorkem při nastavené teplotě a tlaku, což umožňuje desorpci analytů a jejich rozpuštění v rozpouštědle (1, 2). Délka statické fáze a počet statických cyklů se upravují podle složitosti matrice a síly interakcí analytů s matricí tak, aby bylo dosaženo vhodné rovnováhy mezi rychlostí zpracování vzorků a úplností extrakce (2).

Krok 6: Proplach rozpouštědlem a profouknutí dusíkem

Po fázi statické extrakce systém propláchne extrakční celu čerstvým rozpouštědlem, které přenese analyty z cely do sběrného systému (2, 6). Mnoho metod končí profouknutím dusíkem nebo jiným inertním plynem. Ten vytlačí zbytkové rozpouštědlo vedením, zajistí úplnější získání extraktu a připraví systém na další vzorek (2, 8).

Krok 7: Sběr extraktu a následné zpracování

U získaných extraktů je vhodné posoudit přítomnost pevných částic, zbarvení, obsah lipidů, solí, vosků, huminových látek, pigmentů nebo jiných spoluextrahovaných složek matrice. Tyto interference mohou ovlivnit výtěžnost, tvar chromatografických píků, iontovou supresi při LC-MS/MS, čistotu nástřikového systému GC, odezvu detektoru a životnost kolony (1, 2, 6). Následné kroky přípravy vzorku po PLE pomáhají odstranit spoluextrahované složky matrice a upravit extrakt tak, aby odpovídal požadavkům na citlivost a selektivitu kvantitativního stanovení pomocí LC nebo GC (1–3, 6).

Klíčové parametry ovlivňující PLE

Při vývoji metody PLE se optimalizuje soubor kritických parametrů, které přímo ovlivňují účinnost, selektivitu a reprodukovatelnost extrakce (2, 6). Tyto parametry jsou zásadní jak pro samotný princip PLE, tak pro rutinní optimalizaci metody.

Teplota

Teplota bývá jedním z nejvýznamnějších parametrů PLE, protože ovlivňuje viskozitu rozpouštědla, rozpustnost analytu a rychlost difúze (1, 2). Vyšší teplota obvykle zvyšuje účinnost extrakce až do určité hranice. Vývoj metody proto často začíná při mírné teplotě, která se následně postupně zvyšuje za současného sledování výtěžnosti (1, 3).

Tlak

Tlak společně s teplotou udržuje rozpouštědlo v kapalném stavu a podporuje jeho pronikání do zhutněných nebo porézních matric (1, 2). Běžné tlaky používané při PLE udržují rozpouštědlo kapalné i při zvýšené teplotě a pomáhají zabránit tvorbě par, které by mohly narušit průtokové cesty rozpouštědla (1).

Volba rozpouštědla

Druh rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel významně ovlivňuje účinnost a selektivitu extrakce. Rozpouštědla se proto volí podle polarity analytu a vlastností matrice (2, 3). V odborné literatuře o PLE se používají rozpouštědla na bázi vody, čistá organická rozpouštědla i jejich směsi, přičemž jejich složení se často optimalizuje tak, aby bylo dosaženo vhodné extrakční účinnosti a zároveň kompatibility s následnou LC nebo GC separací (2, 3).

Doba statické fáze a počet cyklů

Počet extrakčních cyklů a délka jednotlivých statických fází patří mezi důležité parametry optimalizované během vývoje metody (2). Obtížné matrice nebo silně zadržované analyty mohou vyžadovat několik statických cyklů, aby bylo dosaženo co nejúplnější extrakce. Jednodušší vzorky lze naopak zpracovat s menším počtem cyklů a zvýšit tak rychlost zpracování vzorků (2, 7).

Objem proplachu a poměr vzorku k rozpouštědlu

Poměr objemu rozpouštědla k hmotnosti vzorku a objem proplachu ovlivňují výtěžnost extrakce i odstranění složek matrice (2, 6). Nedostatečné množství rozpouštědla může omezit výtěžnost analytu, zatímco nadměrné objemy již nemusí přinášet odpovídající zlepšení. Při optimalizaci těchto parametrů se proto sleduje vývoj výtěžnosti extrakce (2, 3, 6).

Předúprava vzorku, velikost částic a sušidla

Předúprava vzorku, velikost částic a činidla nebo sorbenty přidané do extrakční cely mohou významně ovlivnit účinnost extrakce i čistotu výsledného extraktu (2, 6). Menší částice zvětšují povrch dostupný pro extrakci, zároveň však mohou zvyšovat protitlak a riziko ucpávání. Sušidla a sorbenty umístěné přímo v cele mohou zlepšit průtok a pomoci omezit množství spoluextrahovaných složek matrice (2, 3, 6).

PLE vs. tradiční extrakční techniky

Phenomenex: Extrakce kapalinou pod tlakem: princip, metoda a pracovní postup

Aplikace PLE

PLE se používá v environmentální analýze, při analýze potravin a nápojů, ve farmaceutických a nutraceutických aplikacích i při práci s biologickými vzorky, zejména tam, kde je zapotřebí co nejúplnější extrakce analytů z pevných matric (2–4, 6).

Environmentální analýza

PLE se široce používá při stopové analýze vzorků životního prostředí, včetně půd, sedimentů, kalů a dalších pevných matric obsahujících organické kontaminanty (2, 4, 6). V environmentálních pracovních postupech je PLE/PFE zvláště vhodná pro pevné matrice, jako jsou půdy, sedimenty, kaly a pevné odpady, pokud cílové sloučeniny spadají do rozsahu zvolené metody. Metoda EPA 3545A se konkrétně vztahuje na ve vodě nerozpustné nebo málo rozpustné organické sloučeniny v těchto typech matric (4).

Analýza potravin a nápojů

PLE se používá u řady potravinových matric k extrakci pesticidů, fenolických sloučenin, tuků a nutraceutických složek z komplexních pevných a polotuhých matric (2, 3). Mezi potravinářské aplikace patří extrakce pesticidů, environmentálních kontaminantů, kontaminantů vznikajících při zpracování, mykotoxinů, reziduí veterinárních léčiv, fenolických sloučenin a analytů spojených s lipidní frakcí. U vzorků s vysokým obsahem tuku nebo pigmentů je zvláště důležitý vhodný způsob čištění, protože intenzivní extrakční podmínky mohou současně zvyšovat koextrakci složek matrice (2, 3).

Farmaceutická a nutraceutická analýza

Ve farmaceutických a nutraceutických analýzách a při analýze rostlinných materiálů lze PLE využít k extrakci cílových účinných látek, markerových sloučenin, reziduálních kontaminantů nebo analytů přítomných v matrici z pevných vzorků, jako jsou bylinné produkty, rostlinné suroviny, vzorky s vysokým obsahem pomocných látek nebo pevné formulace. Podmínky metody je nutné zvolit tak, aby byla zachována stabilita analytů a získaný extrakt byl kompatibilní s HPLC/UHPLC, LC-MS/MS, GC nebo GC-MS analýzou (3).

Zvýšená teplota a tlak mohou při použití vhodného systému rozpouštědel zlepšit účinnost extrakce celé řady sloučenin. U termolabilních analytů je však nutné pečlivě ověřit jejich stabilitu, protože zvýšená teplota během extrakce může podporovat jejich degradaci nebo přeměnu (3).

Biologické a klinické vzorky

Použití PLE bylo popsáno také u vybraných biologických a klinických výzkumných vzorků. Tyto aplikace však vyžadují pečlivé posouzení metody, protože proteiny, lipidy, soli a endogenní sloučeniny mohou zvyšovat matriční efekty a zvyšovat nároky na následné čištění extraktu. Tvrzení v této části by měla zůstat konzervativní, pokud nejsou doložena konkrétními příklady (6). V odborné literatuře je popsáno také spojení PLE s derivatizací, které může zlepšit selektivitu a snížit detekční limity při analýze biologických matric, například tkání nebo biologických tekutin (6).

Výhody a omezení PLE

Při zvažování, zda PLE zařadit mezi používané metody přípravy vzorků, je důležité posoudit jak její výhody, tak omezení (1, 3, 6, 7).

Výhody

Díky tomu, že zvýšená teplota a řízený tlak zlepšují interakci rozpouštědla s matricí, může PLE často dosahovat výtěžnosti srovnatelné s tradičními extrakčními postupy, avšak při kratší době extrakce a nižší spotřebě rozpouštědel. Výkonnost metody je přesto nutné ověřit pro každý analyt a matrici (1, 3, 7).

Při použití automatizovaných systémů může PLE zlepšit konzistenci výsledků mezi jednotlivými sériemi vzorků a omezit manuální manipulaci. Celková efektivita pracovního postupu však závisí také na přípravě extrakčních cel, době extrakce, požadavcích na čištění a kapacitě přístroje (3, 7). Protože je extrakční cela uzavřená a tlakovaná, omezuje PLE také odpařování rozpouštědel a expozici obsluhy ve srovnání s metodami využívajícími otevřené extrakční nádoby, například Soxhletovou extrakcí. Vedle výhod z hlediska výtěžnosti tak přináší i praktické výhody v oblasti bezpečnosti a reprodukovatelnosti (3, 6).

Omezení

Pořizovací náklady na systémy PLE jsou vyšší než u jednoduchých extrakčních aparatur založených na laboratorním skle, protože přístroje musí pracovat při zvýšené teplotě a tlaku a umožňovat automatický přívod rozpouštědla. Pro některé laboratoře tak mohou představovat významnou investici (3, 7). Příprava extrakčních cel může být rovněž pracnější než u běžných extrakčních postupů, protože vzorky je nutné homogenizovat, smísit s dispergačními materiály nebo sorbenty a pečlivě naplnit do cel tak, aby nevznikaly preferenční průtokové cesty (2, 6, 8).

Intenzivní extrakční podmínky mohou vést ke koextrakci lipidů, pigmentů, huminových látek, vosků, solí nebo dalších složek matrice. Tyto interference mohou ovlivnit chromatografickou separaci, odezvu detektoru, iontovou supresi při LC-MS/MS, čistotu injektoru GC a životnost kolony. Při vývoji metody je proto vhodné zvážit použití sorbentů pro čištění přímo v extrakční cele a následné techniky čištění extraktu, například SPE, disperzivní SPE, SLE, filtraci, centrifugaci nebo postupy typu QuEChERS (2, 3, 6). Vyšší teploty mohou být problematické také pro termolabilní analyty, proto je nutné ověřit, zda zvolené podmínky zachovávají stabilitu cílových sloučenin a současně poskytují přijatelnou výtěžnost (1, 3).

Tipy pro optimalizaci metody PLE

Při optimalizaci metody PLE lze využít několik praktických doporučení, která propojují podmínky extrakce s požadavky následné LC nebo GC analýzy (1–3, 6, 7).

Sušení a předúprava vzorku jsou zásadní, protože nekontrolovaná vlhkost a nedostatečná homogenizace často vedou k variabilitě účinnosti extrakce a průběhu extrakce v cele (2, 6). Kontrola velikosti částic a smísení vzorku s vhodným dispergačním materiálem nebo sušidlem pomáhají udržovat stabilní protitlak a rovnoměrný přístup rozpouštědla v celé náplni cely (2, 3, 6).

Praktickým výchozím bodem může být použití kombinací rozpouštědel, které již byly validovány pro Soxhletovu nebo extrakci kapalina–kapalina stejné matrice. Jejich poměry lze následně upravit s ohledem na vyšší teplotu a tlak používané při PLE, namísto výběru rozpouštědel zcela od začátku (2, 3, 7). Použití sorbentů nebo činidel pro čištění přímo v extrakční cele může omezit množství spoluextrahovaných složek matrice, zejména u vzorků s vysokým obsahem tuku nebo pigmentů, a zlepšit výsledky následné chromatografické analýzy (3, 6).

U obtížných matric se běžně používá několik extrakčních cyklů s cílem dosáhnout co nejúplnější extrakce. Výtěžnost se přitom sleduje v jednotlivých cyklech, aby bylo možné eliminovat zbytečné kroky (2, 7). Nové metody PLE se obvykle validují ve srovnání se zavedenými referenčními technikami, jako je Soxhletova extrakce nebo extrakce pevná látka–kapalina. Cílem je prokázat, že PLE poskytuje srovnatelnou nebo lepší výtěžnost, preciznost a přesnost a zároveň zkracuje dobu extrakce a snižuje spotřebu rozpouštědel (3, 5, 7).

Často kladené otázky k PLE

Jaký je rozdíl mezi PLE a ASE?

Extrakce kapalinou pod tlakem (PLE) je obecné označení techniky, která využívá kapalná rozpouštědla při zvýšené teplotě a tlaku k extrakci analytů z pevných nebo polotuhých vzorků. Urychlená extrakce rozpouštědlem (ASE) je označení často používané v souvislosti s konkrétními přístroji a provedením PLE pro pevné vzorky, mimo jiné v regulačních dokumentech, jako je metoda 3545 a související metodické pokyny. Systémy ASE využívají stejný základní princip jako PLE; PLE lze tedy chápat jako obecné označení techniky a ASE jako označení používané především v souvislosti s konkrétními přístrojovými a metodickými řešeními.

Jaká teplota a tlak se při PLE používají?

Typické metody PLE využívají kapalná rozpouštědla při teplotách přibližně 50 až 200 °C a tlacích zhruba 10 až 20 MPa. Tyto podmínky udržují rozpouštědlo v kapalném stavu a současně zvyšují rozpustnost analytů a rychlost difúze, čímž zvyšují účinnost extrakce a zkracují její dobu ve srovnání s extrakcí za běžných podmínek.

Která rozpouštědla se při PLE používají?

Při PLE se používají běžná kapalná rozpouštědla, včetně vody, organických rozpouštědel a jejich směsí přizpůsobených polaritě analytu a vlastnostem matrice. V odborné literatuře jsou popsány například metody využívající směsi s vysokým podílem vody pro polárnější sloučeniny a organické směsi pro hydrofobní analyty. Rozpouštědla se volí také s ohledem na kompatibilitu s následnou LC nebo GC analýzou.

Jaké vzorky lze analyzovat pomocí PLE?

PLE se používá pro širokou škálu pevných a polotuhých vzorků, včetně půd a sedimentů, potravinových a krmivářských matric, bylinných materiálů, nutraceutických složek a biologických vzorků používaných při stopové analýze. Pro PLE jsou vhodné zejména matrice, které lze naplnit do extrakční cely a které jsou stabilní za zvolených teplotních a tlakových podmínek. PLE tak umožňuje flexibilně začlenit přípravu vzorků do moderních pracovních postupů využívajících HPLC a GC.