SPE Troubleshooting: Proč vzorek neprotéká SPE kolonkou?

V tomto tipu zaměřeném na řešení problémů při extrakci na pevné fázi (SPE) odpovídá Genevie Hodson, Senior manažer technické podpory a aplikací ve společnosti Phenomenex, na častou otázku zákazníků:

„Můj vzorek neprotéká SPE kolonkou. Proč se to děje?“

Příčin problémů s průtokem může být několik. Systematický přístup k diagnostice pomáhá odhalit skutečnou příčinu a obnovit správnou funkci SPE metody.

Určení okamžiku vzniku problému

Prvním krokem při řešení problému je zjistit, ve které fázi SPE postupu se problém objevuje.

Je třeba si položit následující otázku:

• Dochází k problému během nanášení vzorku (loading)?
• Nebo se problém objeví již před nanesením vzorku, například během kondicionace sorbentu nebo při průchodu slepého vzorku (blank)?

Okamžik výskytu problému významně napovídá jeho příčině.

Příčina 1: Viskózní nebo zakalený vzorek

Popis problému

Viskózní vzorky nebo vzorky obsahující velké množství pevných částic mohou omezovat průtok SPE kolonkou.

Doporučené řešení

Před SPE je vhodné vzorek:

• Naředit
• Odstředit
• Přefiltrovat

Další možností je použití sorbentu s větší velikostí částic.

Příklad

• Strata-X – velikost částic 33 µm
• Strata XL – velikost částic 100 µm

Strata XL je vhodnější pro viskózní vzorky a umožňuje lepší průtok.

Kdy se problém projeví

Pokud je příčinou viskozita nebo vysoký obsah částic, projeví se problém během nanášení vzorku na kolonku.

Příčina 2: Nedostatečný tlak v manifoldu

Popis problému

• Příčina může souviset s manifoldem nebo použitou instrumentací.
• Pro zajištění správného průtoku musí být tlak dostatečný.

Doporučené řešení

Je vhodné zkontrolovat:

• SPE manifold
• Připojenou instrumentaci
• Jednotlivé pozice v manifoldu

Někdy může být problém způsoben pouze jedním konkrétním místem v systému.

Kdy se problém projeví

Pokud je příčinou tlak v manifoldu, projeví se problém již během:

• Kondicionačních kroků
• Průchodu slepého vzorku (blank)

Příčina 3: Nemísitelná rozpouštědla

Popis problému

Použití nemísitelných rozpouštědel může narušit průchod kapaliny SPE kolonkou.

Doporučené řešení

Vždy používejte vzájemně mísitelná rozpouštědla.

Příklad

• Hexan
• Voda

Tato rozpouštědla jsou nemísitelná a jejich společné použití může způsobit problémy s průtokem.

Kdy se problém projeví

Problémy způsobené nemísitelností rozpouštědel se obvykle projeví během:

• Kondicionace sorbentu
• Průchodu slepého vzorku (blank)

Příčina 4: Sraženiny a precipitace proteinů

Popis problému

• Vysrážené složky vzorku nebo proteiny mohou vytvářet sraženiny, které ucpávají sorbent.
• To může výrazně zpomalit nebo zcela zastavit průchod vzorku SPE kolonkou.

Doporučené řešení

Možná nápravná opatření zahrnují:

• Naředění vzorku
• Snížení objemu vzorku
• Vyhnutí se denaturačním rozpouštědlům
• Promytí sorbentu pufrem s nízkou iontovou silou před standardním promývacím krokem

Kdy se problém projeví

Pokud jsou příčinou precipitované proteiny nebo jiné vysrážené složky vzorku, problém se typicky objeví po nanesení vzorku.

Systematický přístup k řešení problémů

Při diagnostice problémů s průtokem je doporučeno postupovat systematicky.

Základní pravidlo

• Vždy izolujte a vyhodnocujte pouze jednu proměnnou najednou.
• Takový přístup umožňuje spolehlivě určit skutečnou příčinu problému.

Nejčastější příčiny problémů s průchodem vzorku SPE kolonkou

Příčina   /   Kdy se projeví   /   Doporučené řešení

• Viskózní nebo zakalený vzorek: Během nanášení vzorku - Naředit, odstředit, filtrovat nebo použít sorbent s větší velikostí částic
• Nedostatečný tlak v manifoldu: Kondicionace nebo blank - Zkontrolovat manifold a instrumentaci
• Nemísitelná rozpouštědla: Kondicionace nebo blank - Používat pouze vzájemně mísitelná rozpouštědla
• Precipitace složek vzorku nebo proteinů: Po nanesení vzorku - Naředit vzorek, snížit objem, vyhnout se denaturačním rozpouštědlům, použít promytí pufrem s nízkou iontovou silou

Závěr

Problémy s průtokem při SPE mohou být způsobeny viskózními vzorky, nedostatečným tlakem v manifoldu, použitím nemísitelných rozpouštědel nebo vznikem sraženin a precipitací proteinů. Klíčovým krokem při diagnostice je určení, ve které části SPE postupu se problém objevuje. Systematické vylučování jednotlivých příčin umožňuje efektivně identifikovat zdroj problému a přijmout vhodná nápravná opatření.