St, 22.4.2026 | Originální článek z: Phenomenex
Jak vybrat správnou SEC kolonu pro biologické molekuly? Praktický přehled podle velikosti, tvaru a typu analytu včetně doporučení pórů a aplikací.Jak vybrat správnou SEC kolonu pro analýzu biologických molekul
- Foto: Phenomenex: Jak vybrat správnou SEC kolonu pro analýzu biologických molekul
- Video: Phenomenex: How to Choose the Right SEC Column | Size Exclusion Chromatography Guide
Tento návod vysvětluje výběr vhodné kolony pro size exclusion chromatography (SEC) při analýze biologických molekul. SEC separuje molekuly na základě jejich hydrodynamického poloměru, tedy podle velikosti a tvaru, nikoliv podle molekulové hmotnosti.
- Molekuly pronikají do pórů stacionární fáze
- Nedochází k chemickým interakcím
- Větší molekuly eluují rychleji
- Menší molekuly eluují později
Princip separace v SEC
- Velké molekuly
→ nevstupují do pórů
→ pohybují se pouze mezi částicemi (intersticiální prostor)
→ eluují dříve - Malé molekuly
→ vstupují do pórů
→ mají delší dráhu
→ eluují později
Klíčové parametry pro výběr kolony
1. Charakter molekuly
Zohledňuje se:
- hydrodynamický poloměr
- tvar molekuly
Příklady:
- peptidy: ~0,7 nm
- AAV: ~25 nm
- mRNA: protáhlý, neglobulární tvar
2. Velikost pórů
- Optimální velikost:
3–4× větší než poloměr analyzované molekuly
3. Velikost částic
- ≤ 3 µm
- zajišťuje vysokou účinnost separace
4. Materiál stacionární fáze
- Preferována mechanicky odolná silika
- Odolnost vůči zpětnému tlaku
5. Povrchová chemie
- Chemická inertnost povrchu je zásadní
- Preferována je diolová chemie, protože:
- minimalizuje interakce s analytem
- poskytuje vysoce hydrofilní povrch
6. Konstrukce kolony
- bioinertní provedení
- zajišťuje:
- minimální ztráty analytu
- vysokou reprodukovatelnost
Dostupné SEC kolony (řada BioZen dSEC)
1. 90 Å (9 nm)
- peptidy
- malé proteiny
- agregáty do ~50 kDa
2. 200 Å
- protilátky
- konjugáty protilátka-léčivo
- krátké oligonukleotidy
3. 700 Å (70 nm)
- AAV
- mRNA
- velké proteinové komplexy (např. IgM)
Charakteristiky kolon
- siliková matrice
- diolová chemie (hydrofilní, inertní)
- bioinertní hardware
- vysoká výtěžnost a reprodukovatelnost
Výkon a kalibrace
Proteiny a AAV
- 90 Å → nízké molekulové hmotnosti (≤ 50 kDa)
- 200 Å → střední rozsah (do ~450–500 kDa)
- 700 Å → velké molekuly (včetně AAV)
RNA a DNA
- separace molekul s neglobulárním tvarem
- 200 Å → menší oligonukleotidy
- 700 Å → dlouhé řetězce (až ~3000–4000 nukleotidů)
Závěr
Správný výběr SEC kolony vyžaduje:
- znalost velikosti a tvaru molekuly
- odpovídající velikost pórů
- vhodnou velikost částic
- inertní chemii a konstrukci
To umožňuje dosáhnout optimální separace biologických molekul.
_s.webp)
